Реферат: Аденилатциклазный сигнальный механизм

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях.

Личный вклад автора – Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43рисунками и 35 таблицами.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar; 2) куры породы русская белая «Леггорн »; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea ; 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и E1A+E1B (клетки, не впадающие в апоптоз).

Методы. В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов:

- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);

- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);

- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).

- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - [α³² P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некоторыми модификациями);

- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [³ H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);

- электрофорез в ПААГ

- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКСζ;

- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [¹⁴ C] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);

- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavinet.al., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003);

- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras ( Плеснёва и др., 2003);

- определение активности ферментов углеводного метаболизма – гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);

- определения содержания белков методом Лоури;

- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина.

- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova).

Результаты исследования и их обсуждение

В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.

Основные этапы работы состояли в исследовании:

- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo ;

- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов;

- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем);

- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии;

Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки