Реферат: Анализ лекарственных веществ в биологических жидкостях
Метаболиты лекарственных веществ могут быть фармакологически активными, а также совершенно неактивными в фармакологическом отношении.
Более высокая активность метаболитов по сравнению с их предшественниками — лекарственными веществами — обусловлена такими факторами, как превращение более полярной молекулы в менее полярную (это приводит к увеличению ее липофильности и облегчению транспорта через биомембраны), усиление внутрипеченочной циркуляции, изменение скорости выведения вещества из организма, перераспределение метаболитов между органами и тканями.
Значительно реже метаболизм приводит к образованию токсических для организма веществ. Так, например, токсичность метилового спирта обусловлена происходящим в организме окислением его молекулы до формальдегида и муравьиной кислоты.
Таким образом, в организме могут происходить как процессы синтеза, так и разрушения (деградации) молекул ЛВ. При синтезе образуются более сложные молекулы новых соединений, менее токсичные для организма и более полярные, что улучшает их растворимость в воде и ускоряет выведение из организма. Такой процесс носит название конъюгации, а продукты синтеза — конъюгатов.
Процесс превращения ЛВ в метаболиты происходит по-разному. Одни практически полностью превращаются в метаболиты, другие — только на несколько процентов от введенной дозы. Из одного лекарственного вещества может образоваться несколько метаболитов, иногда десятки. Образовавшиеся метаболиты либо выводятся из организма, либо подвергаются дальнейшим превращениям.
В соответствии с современными представлениями метаболические процессы условно делят на две фазы. В первой фазе в результате процессов окисления, восстановления или гидролиза изменяется молекула ЛВ с образованием функциональных групп, имеющих активные атомы водорода (оксигруппы, карбоксигруппа, первичные и вторичные аминогруппы и др.). Во второй фазе происходит процесс конъюгации образовавшихся функциональных групп с высокополярными кислотными остатками глюкуроновой, серной кислот, некоторыми аминокислотами и др. В результате этого процесса гидрофильность молекул метаболитов возрастает настолько, что они легко выводятся с мочой. Не все ЛВ метаболизируются по указанной двухфазной системе. Некоторые из них образуют конъюгаты, минуя первую фазу, другие после первой фазы выводятся почками без последующей конъюгации.
На биотрансформацию ЛВ влияют пол, возраст, условия жизни, характер питания, заболевания и т.д. Кроме влияния различных заболеваний, возможны также индивидуальная вариабельность кинетики метаболизма, индукция и угнетение метаболизирующих ферментов. Все это свидетельствует о том, что биотрансформация ЛВ является чрезвычайно сложным процессом, зависящим от многих экзогенных и эндогенных факторов.
Исследование механизма процессов метаболизма — проблема, которая входит в круг задач различных областей химических, биологических, фармацевтических наук, в том числе фармацевтической химии.
7. Сравнительная оценка методов, используемых в биофармацевтическом анализе
Большое значение имеет выбор метода проведения биофармацевтического анализа при фармакокинетических исследованиях. Избранный метод должен иметь высокую чувствительность, возможность работы с малыми объемами проб, большую специфичность и избирательность, отличаться быстротой выполнения анализа, простотой подготовки анализируемых проб, несложностью обслуживания аналитического прибора, надежностью и воспроизводимостью метода, его универсальностью (пригодностью для анализа различных ЛВ), малой трудоемкостью, большой производительность«) и возможностью автоматизации процесса анализа.
Избранный для этой цели метод должен быть настолько чувствительным, чтобы он позволял достоверно и точно определять в 10 раз меньшее количество, чем среднее количество вещества, всасывающееся после приема однократной дозы. Вместе с тем метод должен быть достаточно специфичным, чтобы определять неизменившуюся часть ЛВ в присутствии его метаболитов и эндогенных соединений.
Требованиям, предъявляемым к биофармацевтическому анализу, отвечают только чувствительные физико-химические методы.
Процесс выполнения биофармацевтического анализа включает несколько последовательно выполняемых стадий: экстракцию из биологической жидкости, разделение, идентификацию и количественное определение ЛВ или его метаболитов.
Перед экстракцией необходимо осадить белки (сульфатом аммония, раствором трихлоруксусной или хлорной кислоты). Для осаждения белков используют обычно пробу, содержащую около 0,2 мл сыворотки крови, к которой добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. При этом достигается полное осаждение сывороточных белков. Надосадочную жидкость декантируют и экстрагируют из нее испытуемые вещества.
Процессы экстракции анализируемых лекарственных веществ и их метаболитов из биологических объектов осуществляют с помощью таких органических растворителей, как диэтиловый эфир, хлороформ, бензол, дихлорэтан, дихлорметан, я-гексан, изопропилхлорид, я-гептан, метиленхлорид, этилацетат, ацетон. Нередко сочетают в экстрагенте два из указанных растворителей. Такой способ называютдвухфазным экстрагированием. Наилучшая полнота разделения достигается, если последовательно извлекают из биологической жидкости ЛВ или его метаболиты несколькими растворителями, например эфиром, этилацетатом, хлороформом, ацетоном, водой. Экстракцию проводят в присутствии кислот, щелочей или буферных растворов, создавая рН среды, оптимальное для извлечения ЛВ или его метаболита.
Вещества, содержащиеся в полученных экстрактах (реэкстрактах), определяют фотометрическим, спектрофотометрическим или флуориметрическим методом.
Весьма перспективен чувствительный экстракционно-фотометрический метод, основанный на экстракции ЛВ из биологической жидкости с последующим взаимодействием с кислотными или основными красителями (бромтимоло- вым синим, метиловым оранжевым, бромкрезоловым зеленым и др.). Образующиеся окрашенные продукты (ионные ассоциаты) нередко специфичны для ЛВ и количественно экстрагируются органическим растворителем (хлороформом, бензолом, дихлорэтаном).
Наиболее часто в биофармацевтическом анализе используютспектрофотометрию в УФ- и видимой областях спектра. Этот метод отличается простотой выполнения и достаточной точностью, не требует большого количества операций при подготовке к анализу испытуемого образца. Сравнительно невысокая чувствительность спектрофотометрических методик (от 1 мкг/мл до 1 мг/мл) ограничивает применение данного метода для тех групп ЛВ, суточная доза которых составляет около 1 г.
Чувствительность флуориметрического анализа — около 0,0! мкг/мл. По сравнению с УФ-спектрофотометрией она выше в 10-100 раз. Поэтому с помощью флуориметрических методик можно подвергать биофармацевтическому анализу ЛВ, суточные дозы которых составляют несколько миллиграммов. Особенно высокой чувствительностью отличаются спектрофлуориметрические определения. Однако следует учитывать, что в биологических жидкостях организма нередко содержатся вещества, обладающие флуоресценцией. Флуоресцировать могут и метаболиты ЛВ.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) широко применяется в биофармацевтическом анализе ввиду высокой разрешающей способности и чувствительности. Повысить разрешающую способность ТСХ можно, используя метод двумерной хроматографии. Метод ТСХ позволяет обнаруживать до 0,025 мг ЛВ. Выполнение анализа занимает от 30 мин до 2 ч. ТСХ отличается простотой выполнения, однако при анализе сложных смесей, содержащих большое число компонентов, этот метод не всегда позволяет достигнуть нужного эффекта. Более перспективно использование ТСХ в сочетании с такими методами, как планиметрия и денситометрия. Биофармацевтический анализ методом ТСХ чаще всего сочетают с УФ-спектрофотометрией и флуоресцентным методом (хроматоспектрофотометрия, хроматофлуоресценция).
Очень перспективно использование в биофармацевтическом анализе масс-спектрометрии. Метод отличается высокой разрешающей способностью, в десятки раз превышающей другие методы. Известны различные варианты масс- спектрометрии. Один из них основан на применении масс-спектрометрии с низкой энергией ионизирующих электронов после предварительного выделения фракции биологической жидкости экстракцией или бумажной хроматографией.
Газожидкостная хроматография (ГЖХ) ввиду высокой чувствительности, хорошей воспроизводимости и точности стоит на одном из первых мест среди физико-химических методов, используемых для анализа ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях. Он позволяет определить микрограммовые и нанограммовые количества этих веществ. До выполнения анализа методом ГЖХ необходимо предварительно осуществлять многократную экстракцию (чаще эфиром, хлороформом или этилацетатом) и реэкстракцию ЛВ и?