а) за допомогою різних речовин біологічного походження (нуклеотиди, ДНК, РНК, полісахариди, конкурентні інгібітори протеїназ);

б) за допомогою синтетичних речовин (модифіковані аналоги нуклеотидів та олігонуклеотидів, хімічні модифікатори амінокислотних залишків білків).

Встановити закономірності впливу ауто-АТ та абзимів, виділених із сироватки крові клінічно здорових людей та молока породіль, на ріст та виживання ракових і трансформованих клітин invitro.

Об’єкт дослідження – аутологічні антитіла сироватки крові і молока людини.

Предмет дослідження – виявлення і очистка аутологічних антитіл різної антигенної специфічності із сироватки крові і молока людини та дослідження їхньої функціональної активності, зокрема, впливу на ріст і виживання клітин.

Методи дослідження. У роботі використано методи препаративної та аналітичної біохімії білків і нуклеїнових кислот (осадження білків сульфатом амонію, діаліз, іонообмінна хроматографія, електрофорез у поліакриламідному та агарозному гелі, ізоелектричне фокусування білків, високоефективна рідинна хроматографія). Проведено комп’ютерний аналіз рівня гомології між первинними структурами протеїнкіназ та білків надродини імуноглобулінів. Застосовано методи дослідження цитотоксичної дії чинників на клітини ссавців invitro (визначення кількості живих і мертвих клітин у культурі, виявлення апоптозу електрофоретичним аналізом нуклеосомної фрагментації ДНК та електрофорезом індивідуальних клітин у гелі агарози (метод ДНК-комет)). Крім того, застосовано імунологічні методи (імуноензимний і цитохімічний аналіз антигенної специфічності антитіл молока людини), а також методи статистичної обробки результатів дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі розробленої схеми очистки антитіл із заданою антигенною специфічністю із сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання (системний червоний вовчак (СЧВ), розсіяний склероз) та молока клінічно здорових жінок уперше очищено каталітично активні антитіла (абзими) класу IgG та IgAзі спорідненістю до АТР (анти-АТР АТ), дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ) і гістону Н1 (антигістонові АТ). Встановлено, що анти-АТР АТ сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і молока клінічно здорових жінок володіють фосфотрансферазною (протеїнкіназною і ліпідкіназною) активністю, анти-ДНК АТ молока людини володіють РНК-азною, ДНК-азною та протеїнкіназною активністю, тоді як антигістоновим АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль властива протеазна активність щодо деяких лужних білків.

Вперше виявлено чинники, які впливають на каталітичну активність абзимів. Показано, що дезоксирибоолігонуклеотиди стимулюють протеїнкіназну активність sIgA-абзимів молока людини, тоді як нуклеотидтрифосфати інгібують їхню нуклеазну активність.

Виявлено, що імуноглобуліни сироватки крові та молока клінічно здорових людей індукують загибель клітин лейкемії шляхом апоптозу. Разом із тим, у сироватці крові окремих хворих на розсіяний склероз присутні імуноглобуліни, здатні індукувати проліферацію лейкемічних клітин людини.

Теоретичне значення одержаних результатів. Вперше обґрунтовано механізм промітогенної дії IgG-абзимів на клітини ссавців, а також механізм каталізу антитілами фосфотрансферазної реакції. Запропоновано модель внутрішньоклітинної нейтралізації вірусів у епітеліальних клітинах за участю sIgA-абзимів.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі проведено аналіз антигенної специфічності, каталітичної та цитотоксичної активності імуноглобулінів, отриманих із молозива клінічно здорових породіль. На основі отриманих результатів зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості важливо врахувати під час комплексного визначення показників ранніх аутоімунних порушень у жінок, пов’язаних із їхньою вагітністю та пологами.

Особистий внесок здобувача. Авторові належить формулювання теми й мети досліджень, вибір об’єктів, а також вибір і розробка методів дослідження, постановка експериментів. Експериментальні визначення, обробка даних, їхній теоретичний аналіз виконані автором самостійно, або за його безпосередньою участю. Автором проведено аналіз даних літератури за темою роботи, сформульовано та обґрунтовано висновки та узагальнення.

Науковим консультантом здійснювалося загальне керівництво проведенням досліджень та обговорення отриманих результатів у період роботи дисертанта в Інституті біології клітини НАН України.

Апробація одержаних результатів. Основні результати дисертації обговорювались на ІІ міжнародній конференції “Catalytic Antibodies and Antibody Engineering” (Шантілі, Франція, 1996); X міжнародному імунологічному конгресі (Нью-Делі, Індія, 1998); Кістоунському симпозіумі з молекулярної і клітинної біології (Брекенрідж, США, 1999); III Парнасівській конференції “Mechanismsofcellularsignaltransductionandcommunication” (Львів, 2000); Міжнародній конференції “RNAasTerapeuticandGenomicTarget” (Новосибірськ, Росія, 2001); конференції НАТО “Frontiersinautoimmunity: fundamentalaspectsandclinicalperspectives” (Кеслей, Угорщина, 2002); Установчому з’їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (Київ, 2005); XI Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006); ІІІ Міжнародній конференції “Фундаментальные науки – медицине” (Новосибірськ, Росія, 2007); ІІ з’їзді українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 38 наукових робіт, із них 25 статей у фахових вітчизняних і міжнародних журналах, 1 огляд та тези 12 доповідей на наукових конференціях.

Зміст та обсяг роботи. Дисертація включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи, результати власних досліджень, що складаються із 9 розділів, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаної літератури, який нараховує 300 найменувань. Текст дисертації викладено на 290 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 118 рисунками і 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідженя. Отримання електрофоретично гомогенних препаратів антитіл є однією із найбільш важливих умов дослідження їхньої функціональної активності. У першу чергу, це стосується каталітично активних антитіл, які володіють аналогічною із ензимами каталітичною активністю. Виділення та очистка абзимів є досить складним завданням. Це зумовлено сукупністю факторів. Відомо, що сумарні препарати імуноглобулінів є поліклональними, складаються із різноманітних за ізотипом антитіл, які мають спорідненість до великої кількості різноманітних антигенів, серед яких є й ензими. Останні можуть знаходитися у комплексі із антитілами, що може бути причиною артефактів при дослідженні їхньої каталітичної активності. Тому на перших стадіях очистки ауто-АТ необхідно відділити антитіла від різноманітних антигенів, у першу чергу від білків. Наступним кроком повинно бути виділення фракції антитіл, яка володіє спорідненістю до антигену – потенційного субстрату каталітичної реакції.

На рис.1 наведено узагальнену схему очистки ауто-АТ із сироватки крові та молока людини, яка дозволяє отримати препарати антитіл із заданою антигенною специфічністю, збагачені каталітично активними антитілами.

На першій стадії очистки імуноглобуліни осаджували 50% сульфатом амонію. Це дозволяє відділити фракцію імуноглобулінів від основної маси білків сироватки крові чи молока. Наступна стадія включає афінну хроматографію на колонці, яка містить протеїн A - або протеїн G - агарозу (або сефарозу). Для видалення домішок колонки промивали розчинами із підвищеною концентрацією NaCl (0,3–0,5 М) у присутності неіонних детергентів (NP-40, тритон Х-100). Елюцію імуноглобулінів із колонки проводили буфером із низьким значенням рН (1 M оцтова кислота або 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6). Використання цих сорбентів дозволяє уже на перших стадіях очистки отримати препарати, які на 90-95% складаються із імуноглобулінів. Для подальшої очистки антитіл або їхнього розділення на субкласи (наприклад, sIgAта IgG молозива) використовували іонообмінну хроматографію або напівпрепаративну гель-фільтрацію (Невинский та ін., 2000). Препарати антитіл, очищені таким методом, є електрофоретично гомогенними (рис.1А, Б) і придатні для виділення антитіл зі спорідненістю до певних антигенів чи субстратів каталітичної реакції.

Отримані препарати імуноглобулінів у подальшому слугували для виділення моноспецифічних поліклональних антитіл із сироватки крові і молока людини афінною хроматографією на колонках, які містять сорбенти із ковалентно зв’язаними лігандами. Сорбентами слугували: АТР-сефароза, ДНК-целюлоза, гістон Н1-сефароза. Залежно від спорідненості до сорбентів, антитіла елюювали градієнтом концентрації 0–1 М NaCl (анти-АТР IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак), 3,5 MMgCl2 (анти-АТР sIgA молозива породіль), 50 мМ NaOH (анти-ДНК sIgA молозива породіль), 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 (антигістонові АТ субкласів IgGта sIgA сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль).

Визначення протеїнкіназної активності. Для аналізу протеїнкіназної активності АТ і rsCD4 донором фосфату був [g-32P] ATP (5000 Ki/ммоль, “Изотоп”, Російська Федерація). Реакційне середовище містило 0,3 – 3 мкг білка,20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5-10 мМ MgCl2, 25 мкКі [g-32P] ATP. У деяких випадках, у реакційне середовище додатково додавали АТР, казеїн коров’ячого або людського молока. Реакцію фосфорилювання проводили впродовж 30 хв при 37 °С і зупиняли додаванням денатуруючого розчину (65 мМ трис-HCl, рН 6,8, 1% Ds-Na, 2% 2-меркаптоетанол, 10% гліцерин) або 10% ТХО. Білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ, або у градієнті 6-16,5% ПААГ у присутності 0,1% DS-Na. Гелі фарбували CoomassieR-250, висушували і піддавали авторадіографії протягом 20 год.

Визначення ліпідкіназної активності. Для аналізу використовували препарати IgGі sIgA різного ступеня очистки. Реакцію фосфорилювання проводили у середовищі, яке містило 20мM трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ MgCl2 і 20 мкКі [g-32P] ATP.32Р-мічені ліпіди екстрагували розчином хлороформ: метанол (2: 1) і розділяли на пластині Kieselgel 60 у системі хлороформ: метанол: 7М NH40H (60: 35: 5). Пластину висушивали і піддавали авторадіографії.

Визначення нуклеазної активності. Нуклеазну активність імуноглобулінів визначали згідно раніше описаної методики (Shusteretal., 1992). Як субстрат використовували надспіралізовану та лінійну форми плазмідної ДНК, тотальну РНК E. coli або рибосомну РНК клітин аденокарциноми людини лінії A549. Для аналізу зразки, які містили 1-5 мкг білка, інкубували із 3-5 мкг нуклеїнових кислот у 20 мМ трис-HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 протягом 1 год при 37 °С. Ефекторами реакції слугували 0,1-3 мМ АТР або 1 мМ GTP, СТР, TTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Продукти реакції розділяли електрофорезом у 1% агарозі у трис-борат-ЕДТА буфері, рН 8,3у присутності 0,001% бромистого етидію. Гель фотографували при ультрафіолетовому освітленні.

Визначення протеазної активності. Для аналізу протеазної активності АТ субстратами слугували гістони тимусу теляти і цитохром С („Fermentas”, Литовська Республіка). Реакцію гідролізу проводили у буфері, який містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5 у присутності 3 мг/мл білка і 0,05 – 0,3 мг/мл АТ упродовж 1-3 год при 37 °С. Реакцію зупиняли додаванням у реакційне середовище 4-кратного денатуруючого буферу (0,2 М трис-HCl, рН 6,8, 4% Ds-Na, 8% 2-меркаптоетанол, 40% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі фарбували CoomassieG-250.

Аналіз каталітичної активності АТ після розділення гель-фільтрацією за умов дисоціації імунних комплексів (рН-шок). Препарати АТ піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 x 5 мм, яка містила ToyopearlTSKHW-55 („ToyoSoda”, Японія). Білки препаратів АТ попередньо осаджували 50% сульфатом амонію й осад розчиняли в 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 або 50 мМ NaOH. Елюцію білків проводили цими ж розчинами. Хроматографічні фракції (300 мкл) збирали, нейтралізували і діалізували проти буферу, що містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 М NaCl протягом 18 год. Вміст білків аналізували електрофорезом у градієнті ПААГ (7 – 18,5%) у присутності 0,1% Ds-Na. Для аналізу каталітичної активності від хроматографічних фракцій відбирали аліквоти (30 мкл), додавали 6 мкг субстрату (плазмідна ДНК, гістон Н1) й інкубували 2 год при 37 °С. Продукти реакції розділяли електрофорезом залежно від природи субстрату.

Афінна модифікація білків реакційно здатними аналогами АТР і олігонуклеотидів. Для виявлення АТР - і ДНК-зв’язувальних ділянок на молекулах білків використовували реакційно здатні похідні АТР(ClR-Р-ppA) і [g-32P] ATP(ClR-32Р-ppA), а також 32Р-мічений 14-мірний дезоксириботимідилат (ClRCH2NHp(T) 14), які були синтезовані к. б. н. Якубовим Л.А. (Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини, Новосибірськ, Російська Федерація). Реакційною групою слугувала алкілуюча сполука 4- [(N-2-хлоретил-N-метил) аміно] бензиламін, приєднана до 5'-кінцевої фосфатної групи олігонуклеотиду абоg-фосфату [g-32P] ATP (рис.2).

Афінну модифікацію білків (sIgA, rsCD4) проводили у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР: 0,14 М NaCl, 10 мМ NaН2РО4, рН 7,5) у присутності 10 мкМ алкілуючого реагенту протягом 45 хв при 37 °С. Конкурентами у реакції слугували: ДНК тимусу теляти, сумарна РНК E. coliі гепарин у концентрації 1 мг/мл або 30 мкМ d(T) 14. Після завершення інкубації до реакційного середовища додавали денатуруючий буфер (2% Ds-Na, 50 мМ трис-НCl, рН 6,8, 4% 2-меркаптоетанол, 20% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 10% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі висушували і проводили їхню авторадіографію.

Імуноензимний аналіз (ІЕА). ІЕА проводили згідно описаної нижче методики. Для сорбції антигенів у лунки 96-лункового планшету для імунологічних аналізів вносили 30 мкл розчину, який містив 2 мкг гістонів або дволанцюгову ДНК у 0,1 М K2CO3/KHCO3, pH 8,6, й інкубували протягом 18 год при 4 °С. Лунки промивали (3 рази) 200 мкл буферу А (1% БСА у ЗФР), додавали 15 мкг антитіл у 200 мкл буферу А й інкубували протягом 2 год при 37 °С. Лунки тричі промивали 200 мкл буферу А, додавали 50 мкл розчину кон’югату білок А – пероксидаза хрону ("Sigma", США) у розведенні 1: 500 й інкубували протягом 1 год при 37 °С. Лунки планшету тричі промивали 200 мкл ЗФР у присутності 0,05% Twin-20 і фарбували розчином діамінобензидин/Н2О2 протягом 30 хв при 37 °С . Реакцію зупиняли 1 М ортофосфорною кислотою. Оптичну густину розчину визначали при довжині хвилі 492 нм на спектрофотометрі NanoDrop ND 1000 („NanoDropTechnologies”, США). Рівень ауто-АТ у лунках вираховували за величиною оптичного поглинання розчину забарвлених продуктів пероксидазної реакції. Визначення проводили у трьох паралельних дослідах.

Клітини та їхнє культивування. У роботі використовували клітинні лінії, одержані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України: Jurkat – лейкемічні Т-лімфоцити периферичної крові людини, Namalwa – В-лімфоцити людини (лімфома Беркіта); L1210 – лейкемічні В-лімфоцити миші, L929 – трансформовані фібробласти миші. Клітини культивували у середовищі RPMI-1640 або DMEM(„Sigma”, США) у присутності 10% сироватки крові ембріонів ВРХ („Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину.