Реферат: Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства

Использование ДНК-маркерных технологий привлекает исследователя прежде всего возможностью работать с самим носителем наследственной информации. Однако для наиболее простых в исполнении методов (RAPD) характерны плохая воспроизводимость и доминантный характер маркера (невозможность различения гомо- и гетерозиготных генотипов). Более совершенные методы трудоемки и дороги в исполнении. Подробнее об этом [2,15,16]. Заключение о недостаточной готовности ДНК-маркерных технологий для широкого использования в сортовой идентификации и семенном контроле сделано специальной Рабочей Группой ISTA (ISTA NB. No 113, 1997). Практически к аналогичным выводам, но только в связи с решением широкого круга проблем генетических ресурсов растений (особенно практических проблем генных банков) пришли участники рабочего совещания, организованного Международным Институтом Генетических Ресурсов Растений (IPGRI) [16 ].

В трудах этого совещания [17], а также в техническом бюллетене IPGRI [18], многих других работах зарубежных исследователей последних лет справедливо отмечается, что разные ДНК-маркерные системы (в первую очередь, наиболее доступные такие как RFLP, RAPD, AFLP) достаточно широко и эффективно используются для выяснения степени родства (или генетических связей) на внутривидовом и межвидовом уровнях. Не смотря, как было сказано выше, на достаточно пессимистическую оценку перспектив и возможностей ДНК-маркерных систем для решения большинства прикладных проблем генетических ресурсов растений, полностью игнорируются реальные достижения и практическое широкое и многолетнее использование в этих целях полиморфизма запасных белков (табл.2) [2-15,19]. Так, например, все проблемы идентификации и регистрации сортов (и генетических ресурсов растений в целом), практические проблемы рациональной организации коллекций планируется решать исключительно с использованием ДНК-маркеров [16-18]. При этом не приводится ни одной разработанной системы идентификации и регистрации генетических ресурсов культуры или группы культур, ни одного примера реального практического использования ДНК-маркерных систем в сортоиспытании или семенном контроле. Создается впечатление, что сторонники исключительного использования ДНК-маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений, семеноводства и семенного контроля по какой-то причине совершенно не знакомы с большим объемом информации (мировой литературой), касающейся практического использования белков в качестве маркеров, не имели дело с реальным генетическим разнообразием вида или культуры, а также с практическими проблемами идентификации сортов, семеноводства и семенного контроля.

Таблица 2.

Результаты деятельности ВИР им. Н.И.Вавилова по изучению и регистрации генетических ресурсов растений с использованием белков семян в качестве маркеров

Название рода	Число изученных н зарегистрированных:			Издано:
Видов	Сортов н дикорастущих популяции	Каталогов белковых формул	Метод, указании
Пшеница	20	4300	12	4
Ячмень	17	255	1	3
Роясь	7	180	1
Овес Тритикале	19 1	215 500	1	3
Этнлопс	25	2080	4
Кукуруза	1	410	2	1
Рнс	17	1776
Сорю	28	155
Пыреи	40	120
Элнмус	33	68
Житняк	4	25
Колосник	8	17
Овсяница	50	26	1
Плевел	9	168	1
Ежа Мятлик Другие злаковые	3 30 131	173 120 1260	1
Фасоль Другие бобовые Картофель	88 118 44	102 510 300	1
Свекла	13	300	2
Капуста Лук Амарант	20 27 5	209 18	105	1
Подсолнечник Лен	30 6	700 40	2	2
Гречиха	4	150
Плодовые Ягодные Цитрусовые	33 21 13	333 160 47
Куфня	26	36
Хохоба	1	50
Цитрусовые	13	47

Распространенной методической ошибкой, встречающейся в работах зарубежных и отечественных исследователей является смешение понятий идентификация и дифференциация или различение сортов, генотипов и т.п. Исследователи, предлагающие новые методы идентификации сортов, образцов, гибридов и т.п., часто вообще не вдаются в подробности требований, предъявляемых к такого рода методам в государственных или иных структурах, имеющих дело с идентификацией и регистрацией сортов, семенным контролем. Идентифицировать сорт (генотип, гибрид, линию, клон) в том числе значит гарантированно узнать его с использованием данного метода в любой ситуации. Для этого надо иметь каталоги и базы данных, охватывающие генетическое разнообразие культуры или в целом вида (см. ниже). Надежный метод записи спектров ДНК и белков (номенклатура компонентов спектра ММ) - принципиальный элемент любой стандартной системы идентификации и регистрации сортов по ММ [3,4,7-13]. Только в этом случае возможен обмен данными между контролирующими лабораториями независимо от их принадлежности (генные банки, коммерческие и государственные контрольно-семенные лаборатории и т.п.)[14].

Во ВННИР им. Н.И.Вавилова еще в начале 70-х годов В.Г.Конаревым, И.П.Гаврилюк и Н.К.Губаревой была разработана номенклатура компонентов электрофоретических спектров глиадина [3-6]. Принципиальное отличие предложенной номенклатуры состоит в том, что она базируется на результатах обстоятельного изучения внутривидовой изменчивости маркерного белка в мировой коллекции. В дальнейшем эта идея была реализована для запасных белков семян большинства важнейших культур (Табл.2). Используя эталонный спектр, составленный для культуры можно записать спектр любого сорта, биотипа, образца в виде так называемых белковых формул [4,14]. В первую очередь это было осуществлено для большого числа родов злаков, включающих важнейшие зерновые и кормовые культуры (табл.2). Был составлен единый эталонный спектр пролами-нов злаков триб пшеницевых (Triticeae Dum.), овсовых (Aveneae Dum.), тимофеевковых (Phleeae Dum.) и мятликовых (Роеае R. Br.). Этот спектр был основан на изучении спектров пролами-нов десятков тысяч отдельных семян (генотипов), включающих все возможные позиции этого белка. Кроме того, для каждой культуры был составлен рабочий эталонный спектр проламина [4,19].

Полиморфизм запасных белков семян бобовых - глобулинов был использован в сортовой идентификации зерновых бобовых культур - гороха, сои, вики, люпина, кормовых бобов, а также кормовых бобовых трав (клевер, люцерна, донник). У бобовых как и у ряда других двудольных растений для целей идентификации были привлечены 7S (вицилиноподобные) и 11S (легумино-подобные) глобулины [4,19]. В настоящее время во ВНИИР им. Н.И.Вавилова сортовая идентификация по спектрам запасных белков (глобулинов) осуществляется у многих других двудольных растений, в частности подсолнечника, свеклы, капусты, салатных растений, рапса, горчицы, гречихи и многих других (табл.2) [4,19]. Так по результатам сравнительного анализа 150 представителей различных видов капустных (Brassica L.) был составлен эталонный спектр круциферина (глобулина) для представителей данного рода, включающего важные кормовые, овощные и технические культуры. По такому спектру записываются формулы круциферина видов, сортов, линий, гибридов представителей этого рода [20].

Аналогичным образом был составлен суммарный (эталонный) спектр гелиантинина (глобулина подсолнечника). Спектр состоит из всех возможных позиций полипептидов этого белка, обнаруженных к настоящему времени при анализе внутривидовой изменчивости [4,19], что позволяет идентифицировать и регистрировать все внутривидовое разнообразие подсолнечника, включая сорта, линии, гибриды [21]. Номенклатуры электрофоретических спектров глиадина были разработаны также специалистами Франции, Канады и ряда других стран [10-12]. Генетическая номенклатура спектров и компонентов проламинов пшеницы и ячменя была предложена и успешно развита в работах А.А.Созинова и его учеников [7-9].

Во ВНИИР им. Н.И.Вавилова генофонд сортов и дикорастущих образцов документируется в виде белковых формул. Полученная информация сохраняется в виде каталогов формул (табл.2) и компьютерных баз данных формул. Для надежной идентификации и регистрации сортового генофонда ведущих зерновых культур и их дикорастущих сородичей в большинстве случаев достаточно электрофореза запасных белков. Иногда приходится использовать другие типы белков, например глютенины или ингибиторы протеолитических ферментов [4, 6, 19].

Принципиальной является проблема соответствия понятий статуса сорта в общепринятом смысле и с использованием молекулярных маркеров. Для корректного подхода к вопросу предварительно проводятся специальные исследования на большом объеме сортов и на внутривидовом разнообразии диких сородичей. Наиболее сложно дело обстоит с перекрестноопыляющимися культурами, поскольку каждый сорт или образец представляет собой сложную смесь различных генотипов, которым соответствуют разные типы спектра белка или ДНК. Такая сортовая или дикорастущая популяция может быть идентифицирована и зарегистрирована по наличию определенных типов спектра и частоте их встречаемости [4,19]. После сформирования баз данных (компьютерных либо каталожных) открываются реальные возможности использования белковых или ДНК-маркеров для решения ряда практических вопросов коллекций, например, некоторых проблем интродукции или пополнения коллекции (табл.1). На основании сравнительного анализа информации заложенной в каталоги или в базы данных в виде белковых формул, а также информации, полученной при анализе вновь поступившего семенного материала, может быть сделан предварительный вывод о степени оригинальности последнего (с целью предотвращения дублирования образцов). Многолетний опыт ВИР показывает, что такая информация, как правило, в дальнейшем подтверждается так называемыми традиционными методами [2].

Для оценки степени генетических различий между образцами, например, образцами разного географического происхождения, или культурными и дикими формами широко используются ДНК- и белковые маркеры. Во ВНИИР им. Н.И.Вавилова мы использовали ПДРФ-маркеры (RFLP) в изучении генетической дифференциации ячменя. Однако, для анализа обширных коллекций метод ПДРФ достаточно трудоемок. Здесь удобнее использовать более простой и достаточно чувствительный RAPD-анализ. Такие работы, в частности, были проведены ВИРом совместно с Национальным Институтом Сельскохозяйственных Исследований (Япония) на образцах дикого и культурного ячменей из коллекции ВИР, а также на ряде других коллекций [22]. Целью работы была оценка взаимоотношений между различными формами культурного и дикого ячменей по полиморфизму фрагментов ДНК, амплифицированных в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD). Полученные результаты позволили разделить изученные сорта и местные популяции на три основные группы, которые, очевидно, отражают основные тенденции в эволюции и географическом распространении культурного ячменя. Обнаружено соответствие выделившихся групп и кластеров культурного ячменя мировым центрам разнообразия культурных растений (генцентрам), выявленным Н.И.Вавиловым, а также современной эколого-географичес-кой классификации ячменя [22].

Аналогичный экспериментальный подход был применен для выяснения структуры коллекций гексаплоидных пшениц. Методом RAPD-анализа изучена степень родства между образцами гексаплоидных пшениц разных эколого-географических групп (более 400 образцов из коллекции ВИР). Исследования проводились также в том числе и в связи с возможностью маркирования генотипов с высоким уровнем зимостойкости, а также в связи с отработкой технологии создания стержневых коллекций. Результаты координатного и кластерного анализа этих данных продемонстрировали, что все изученные образцы гексаплоидных пшениц представляют собой единый генный пул, который делится на четыре большие группы. Обнаруженное деление находится в полном соответствии с эколого-географической классификацией предложенной Н.И.Вавиловым [23]. Удалось идентифицировать праймеры, позволяющие выделять группы образцов с ценными адаптивными свойствами (например, холодостойкость). Это свидетельствует о перспективности данного подхода к анализу мировой коллекции как исходного материала для селекции по важнейшим признакам. Подобные исследования с использованием ДНК-маркеров проведены недавно сотрудниками ВИР на коллекциях овса, проса, вики, риса. Использованию белковых маркеров для решения вопросов внутривидовых связей посвящено большое число публикаций, в том числе сотрудников ВИР [4,7,10,11,19,24].

Анализ межвидового (междугеномного) родства имеет значение не только для решения вопросов филогении и систематики, но, главным образом, для селекции, базирующейся на методах отдаленной гибридизации. Молекулярно-биологические методы (ДНК-гибридизация, имму-нохимические методы, электрофорез белков) были на первом этапе применены для анализа родства видов и геномов, ревизии схем филогении и происхождения геномов, созданных на базе классических, в том числе цитогенетических методов. В ВИРе применение эффективных имму-нохимических подходов и методов для геномного анализа пшениц и эгилопсов привело в 70-е годы к принципиально новому решению вопроса происхождения первых геномов мягкой и твердой пшениц [4,19,25], что позволило отделу пшениц ВИР создать новую систему рода Triticum L.[26]. Два года спустя наши данные о происхождении первого генома мягкой и твердой пшениц от диплоидного вида близкого к современной однозернянке T.urartu Thum. были подтверждены британскими цитогенетиками [27] и лишь 14 лет спустя в 1988 году и американскими генетиками и молекулярными биологами с использованием ДНК-геномных маркеров [28]. Анализ межвидового и геномного родства был осуществлен в ВИРе с использованием геномноспецифичных белковых маркеров у многих культурных растений и их диких сородичей [4,6,19]. Для анализа межвидовых (межгеномных) отношений, решения вопросов филогении в ВИРе используются также RAPD- и RFLP-маркеры [29,30].

Для нормального существования коллекций, а также для повышения эффективности их использования в селекционном процессе и исследовательской работе важную роль играет соблюдение определенных норм и принципов формирования таких коллекций.

Так при поиске ошибок в определении образцов коллекции в ряде случаев очень полезны могут быть белковые либо ДНК-маркеры. Характерным является пример работы с коллекцией вида T.persicum Vav., проведенной еще в 70-е годы. Представители этого тетраплоидного вида пшеницы морфологически очень трудно отличимы от так называемой «персикоидной» формы гексаплоидной пшеницы. После изучения белков семян коллекции T.persicum методом электрофореза выяснилось, что из 116 образцов 38 оказались гексаплоидами типа «персикоидес» [2]. Конечно, можно было изучить всю коллекцию кариологическим методом, но это достаточно трудоемкий процесс.

Диплоидные пшеницы T.urartu и T.boeoticum отличить по морфологии в состоянии только узкие специалисты. С помощью электрофоретических и, особенно, серологических маркеров сделать это не представляет труда [4,19]. До опубликования наших работ в 1974 году[25], многие зарубежные генетики и тритикологи вообще не признавали пшеницу Урарту за самостоятельный вид. Сохранение ГРР ex situ. Задача ex situ консервации есть поддержание образцов без изменения их генетической конституции [17]. Необходимо свести к минимуму возможность изменений, происходящих с образцами посредством мутаций, селекции, случайного дрейфа или засорения. Это одно из важнейших условий полноценного функционирования генных банков любых организмов. Контроль за генетической целостностью - подлинностью, чистотой хранимого (и периодически пересеваемого) материала - важнейшая задача генного банка. Проблема идентификации в мировых коллекциях дублетов и так называемых очень сходных образцов остро встала в генных банках, особенно с крупными коллекциями. В решении всех этих задач молекулярные технологии оказались очень полезными [2,4, 17,19, 31-33]. Так в ВИРе накоплен большой опыт по использованию спектров запасных белков семян для анализа динамики популяций перекрестноопыляющихся культур (и генотипического состава самоопыляющихся) в процессе репродукции образцов. В коллекции ВИР сохраняется большое число образцов старых русских местных сортов мягкой озимой пшеницы и других местных сортов и форм. Было показано, что старые сорта, сорта народной селекции имеют более высокий уровень популяционного полиморфизма по сравнению с современными сортами, что делает их ценным источником генетического разнообразия для улучшения современных сортов [4,19,34,35]. Задача генных банков и центров генетических ресурсов растений не только собрать, зарегистрировать и изучить эти образцы, но и сохранить все богатство генетической изменчивости этих уникальных форм.

Специальные исследования были проведены в ВИРе на 6 образцах стародавних мягких пшениц - Банатках. В течение трех лет (1988-89, 89-90,90-91) образцы высевались на Кубанской ОС ВИР. Контроль за составом генотипов осуществлялся по спектрам глиадинов. Было показано, что у образца к-4816 в течение трех лет концентрация доминирующего генотипа «а» снизилась с 78% до 52%, а генотипа «в» повысилась с 6 до 33%. У образца к-10230 концентрация доминирующего генотипа «а» снизилась с 84% до 57%, а генотипа «б» повысилась с 7% до 31%. Таким образом, через три года репродукции генотипный состав образцов несколько изменился [35,36].

Генетические коллекции - особо ценный материал, сохранность которого сопряжена с многими методическими трудностями. Белковые маркеры используются в ВИРе для контроля за стабильностью генотипов растений, представляющих генетические линии, для идентификации чужеродных транслокаций, мутаций, изменения числа и состава хромосом. Так сравнительный анализ спектров глиадинов соротов-оригиналов мягкой пшеницы с транслокациями и замещениями пшеничной хромосомы на ржаную (1B/1R) и их репродукций показал, что что у ряда репродуцированных образцов встречаются генотипы с отсутствием глиадиновых маркеров короткого плеча хромосомы 1RS ржи. Эти и многие другие примеры указывают на необходимость контроля чистоты и целостности коллекций в процессе их репродукции.

Любой хранитель (собственник) генетических ресурсов заинтересован обеспечить как охрану своих авторских прав на исходный материал, источники и доноры, так и официальное признание участия этого генетического материала в создании тех или иных сортов в своей стране и за рубежом. ММ оказывают здесь реальную помощь, обеспечивая независимую информацию о происхождении и степени родства генетического материала сравниваемых образцов. В ВИРе накоплен большой опыт использования белковых маркеров в решении спорных вопросов авторства сортов, их оригинальности, подлинности, чистоты, природы исходного материала и т.д., когда использование набора традиционных методов, в том числе и грунт контроля, не давало желаемого результата [4,19]. Эффективность такой работы во многом обеспечивается наличием в ВИР каталогов белковых формул и баз данных этих формул с информацией о сотнях сортов, в том числе давно снятых с районирования, а также о многих образцах различного происхождения, хранящихся в коллекции (табл.2). Важно подчеркнуть, что даже не являясь тестом, который может быть официально признан как единственный аргумент, молекулярный метод обеспечивает предварительную, независимую и оперативную информацию.

Использование молекулярных маркеров в селекции. Белковые маркеры на протяжении последних десятилетий используются в селекционных программах для решения многих вопросов (табл. 1). Этому посвящено большое число отечественных и зарубежных публикаций [6,7]. В ВИРе проламиновые спектры, в частности, используются для отбора определенных генотипов (по соответствующим типам спектра) при селекции различных культур. Так в ходе селекции сорта озимой пшеницы «Тюменская ранняя» с помощью спектров глиадина формировался «желаемый» генотипный состав создаваемого сорта (НИИСХ Северного Зауралья).

Весьма наглядным является пример связи между белковой формулой генотипов у сортов озимой мягкой пшеницы и устойчивостью этих генотипов (сортов, имеющих данные генотипы) к низким температурам. Одним из основных свойств, которым должна обладать озимая мягкая пшеница является зимостойкость. Из характеристик, обуславливающих зимостойкость, наиболее изучена морозостойкость. Последняя контролируется многими генами, локализованными в разных хромосомах. Это, естественно, затрудняет исследование признака зимостойкости, его маркирование и соответствующую селекцию. По данным А.А.Созинова и сотрудников [7] сорта озимой пшеницы, в составе спектров глиадина которых присутствуют определенные блоки компонентов, обладают повышенной зимостойкостью. Согласно биохимической номенклатуре компонентов глиадина, разработанной в ВИРе это соответствует компонентам: г2щ78 (блок Gld 1A1), г1щ67 (блок Gld 1A2), г13щ5819 10 (блок Gld 1D5), 62467в1 (блок Gld 6A3) и 657в245 (блок Gld 6D2). Исследования были проведены на большом числе сортов озимых мягких пшениц (около 300) разных экологических групп (групп селекции) [36]. Морозостойкость растений определялась методом прямого промораживания в посевных ящиках. Дифференциирующими температурами были -15С и -18С. Действительно, большинство сортов с высокой и повышенной морозостойкостью характеризуется указанными выше блоками (группами) компонентов глиадина. Так на большом числе сортов показано, что наличие генотипа с компонентами 62467 и щБ^ 10 придает сорту повышенную морозостойкость (табл. 4) [36]. Дело, однако, усложняется в ходе анализа генотип-ного состава сортов. Как правило, не удается обеспечить 100% концентрацию выдающихся генотипов по одному признаку и селекционеры вынуждены «разбавлять» сорт другими генотипами, обеспечивающими другие характеристики, но, обладающими меньшей зимостойкостью. Особенно хорошо это заметно при анализе родословных некоторых наших отечественных сортов озимой мягкой пшеницы. В родословной озимых мягких пшениц одесской селекции на первом этапе присутствует морозостойкий сорт Гостианум 237 (группа морозостойкости 1). Выяснено, что если после последующих скрещиваний полученные сорта по проламиновым спектрам были близки к Гостианум 237 (в частности, по наличию и частоте встречаемости генотипов с компонентами 62467 и компонентами 8Х9 10 в щ-зоне), они также обладали хорошей морозостойкостью. Таким образом, спектры глиадина можно использовать для определения потенциальной морозостойкости сортов озимой мягкой пшницы в пределах определенных групп селекции. При этом необходимо знать белковую формулу генотипа (генотипов) морозостойкого сорта, который явился источником данного признака в ходе селекции. Это позволит вести контроль за включением его генетического материала во вновь создаваемые сорта.