Реферат: Биогенез мембран
Проблема сборки белков очень важна. Как мы увидим, этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липид-ным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану и сборка интегральных мембранных белков — это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом. Прежде чем обсуждать общие особенности сборки молекул в различных системах, полезно остановиться на методах экспериментального исследования этого процесса.
Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и про-теолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоро-пластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli; они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.
Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или по крайней мере через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. Как показано схематически на рис. 10.7, за ходом протеолити-ческого процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидиом геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции; при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.
В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые раство-
римые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата». Аналогичные исследования можно проводить in vivo с помощью метода импульсного мечения. При этом уменьшается вероятность появления артефактов, связанных с искусственностью бесклеточных систем. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропласт ах и митохондриях, а также — после длительных дискуссий — для переноса через бак-
термальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако в конце концов было четко показано, что такая параллельность не обязательна. По крайней мере в одном случае — для препро-а-фактора — наблюдался посттрансляционный транспорт в микросомы дрожжей, не зависящий от рибосом. Было также показано, что хотя у высших эукариот для переноса через эндоплазматический ретикулум элонгации белков не требуется, в большинстве случаев процесс переноса все же зависит от рибосом и происходит в то время, когда новосинтезиро-ванный полипептид еще удерживается рибосомой, Важный вывод состоит в том, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.
Заметим, что эти данные лишь констатируют то, что процессы переноса и трансляции можно разграничить экспериментально. В клетке эти процессы тесно связаны, по крайней мере, в случае белков, транспортируемых в эндоплазматический ретикулум клеток млекопитающих, и многих белков Е. coli.
2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотиче-ских систем является гидролиз АТР. Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс, внутреннюю и наружную мембраны; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей и пост-трансляционного встраивания мембранного белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих; г) переноса белков через цитоплазматическую мембрану E.coli. Ни в митохондриях, ни в мембранах Е. coli АТРазная активность не принадлежит АТРазе и ее роль не состоит в генерированнии трансмембранного потенциала.
Еще одним независимым условием переноса белков в матрикс митохондрий и во внутреннюю мембрану митохондрий является наличие на последней трансмембранного потенциала. Этот потенциал, очевидно, необходим на ранней стадии процесса, при связывании белка с митохондрией. Для транспорта по крайней мере некоторых белков в хлоропласт это условие не является обязательным. Однако для оптимизации переноса белков через плазматическую мембрану E.coli также нужна трансмембранная протондвижущая сила. Заметим, что направление переноса белков относительно полярности в Е. coli и митохондриях противоположно, а имеет ли мембрана эндоплазматического ретикулума трансмембранный потенциал — неизвестно.
3. Способность предшественника к переносу. Имеются веские доводы в пользу того, что ключевую роль в успешном переносе белка играет его четвертичная структура. Скорее всего это связано с тем, что сигнальная последовательность, узнаваемая аппаратом переноса, должна быть доступна для него. Следовательно, для осуществления переноса белок должен быть неплотно свернут или частично развернут. Кроме того, если белки переносятся через мембрану в вытянутой конформации, то аппарат переноса должен быть способен к их развертыванию во время самого процесса переноса. Если бы белки-предшественники обладали стабильной четвертичной структурой, то они с трудом развертывались бы и, следовательно, не были способны к переносу.
Наиболее четкие данные о том, что белки транспортируются в вытянутой конформации, получены в работе, авторам которой удалось идентифицировать интермедиаты при переносе двух разных белков в матрикс митохондрий. Было показано, что N-кон-цы этих интермеднатов погружены в матрикс, а основная их часть находится вне митохондрии. Таким образом, интермедиаты должны протянуться через внутреннюю и наружную мембраны; при этом полагают, что место их входа совпадает с местом слияния двух мембран.
Белки могут транспортироваться через мембрану только в развернутом виде
Шац и др. изучали перенос через мембрану тетраги-дрофолатредуктазы, к которой была искусственно присоединена митохондриальная сигнальная последовательность; без этой последовательности белок не мог проникать в митохондрию. После внедрения в матрикс митохондрии сигнальная последовательность удалялась сигнальной пептидазой. Чтобы выяснить, может ли проходить через мембраны митохондрий белок, находящийся в свернутой конформации, измеряли эффективность транспорта в присутствии метотрексата — ингибитора, который с высокой избирательностью связывается с нативной формой тетрагидрофолатредуктазы. Обнаружили, что связывание метотрексата приводит к прекращению транспорта, возможно вследствие того, что ингибитор стабилизирует фермент в компактной форме. Было показано также, что для проникновения в митохондриальный матрикс предшественника 0-субъединицы FiFo-АТРазы необходимо его развертывание.
Изучался транспорт в митохондрии укороченных предшественников тетрагидрофолатредухтаэы. Они содержали митохои-дриальную сигнальную последовательность, но трансляция была прервана до завершения синтеза полипептида. Такие укороченные предшественники не связывали метотрексат, а возможно, и ие могли свертываться в конформацию, подобную нативной. Однако они проникали в митохондрии. Особый интерес представлял тот факт, что транспорт укороченных предшественников в отличие от транспорта полноразмерного белка мог осуществляться в отсутствие ATP. Это еще раз подтверждало тот факт, что ATP необходим для разворачивания полипептида. На рис. 10.8 схематически представлена модель процесса переноса белков в митохондрии с указанием стадий, протекающих лишь при наличии трансмембранного потенциала и АТР.
К аналогичным выводам о роли АТР привело исследование транспорта порина в наружную митохондриальную мембрану. Этот белок не имеет отщепляемой сигнальной последовательности, и вся необходимая для транспорта информация закодирована внутри молекулы зрелого белка. Белок был выделен в водорастворимой форме, вероятно частично денатурированной, но и в таком виде был способен к переносу. Перенос водорастворимого предшественника не требовал АТР. Этим он отличался от белка, который проникал в митохондрию сразу по завершении синтеза в системе in vitro. По-видимому, и в этом случае АТР требуется для активного процесса разворачивания белковой молекулы.
Перенос белка, связывающего мальтозу, через плазматическую мембрану £. coli в периплазматическое пространство тоже зависит от конформации предшественника. Так, мутаитный белок с измененной сигнальной последовательностью, ие способный к транспорту, менее чувствителен и к протеолитическому расщеплению, т. е. более плотно свернут. Белок же, в большей степени подверженный протеолизу, способен и к переносу. Это согласуется с данными по митохондриям. По-видимому, при наличии сигнального пептида на N-конце замедляется укладка полипептида. Интересен тот факт, что мутация в сигнальном пептиде, которая приводит к блокированию переноса, может супрессироваться второй мутацией в зрелом белке. Предшественник, несущий обе мутации, значительно менее стабилей в цитоплазме, чем молекулы с одной мутацией в сигнальной последовательности, возможно, из-за того, что он находится в более развернутой конформации.
Обсуждался и вопрос о том, что, по-видимому, для предотвращения свертывания предшественника в нативную конформацию необходим какой-то растворимый белковый кофактор. Так, был выделен в водорастворимой форме, сходной с порином митохондрий, предшественник белка наружной мембраны Е. coli OmpA, который был не способен к эффективному переносу через плазматическую мембрану, если в цитозоле отсутствовал белок, называемый «триггер-фактором». Давно известно, что для переноса белков через мембраны эндоплазматического ретикулума млекопитающих или в эндоплазматический ретикулум необходим растворимый кофактор, а именно — сигнал-распознающая частица. Возможно, роль этого фактора состоит в предотвращении сворачивания предшественника полипептида.
4. НУЖНЫ ЛИ ДЛЯ ПЕРЕНОСА БЕЛКОВ КАНАЛЫ?
Экспериментальные данные, которые однозначно свидетельствовали бы о существовании каналов, участвующих в сборке мембранных белков или в переносе белков через мембрану, отсутствуют. Известно, впрочем, что как на поверхности митохондрий, так и в эндоплазматическом ретикулуме имеются мембранные рецепторы, которые специфически узнают переносимые белки, и, возможно, именно они являются частью сложного аппарата, куда входит и канал, по которому перемещается белок.
Для того, чтобы перенос белков происходил со скоростью, близкой к скорости синтеза полипептида, энергетический барьер не должен превышать примерно 18 ккал/моль. По данным работы, две соседние спирали могут спонтанно встраиваться в бислой с образованием спиральной шпильки, и соответствующий выигрыш свободной энергии - 60 ккал/моль может стать движущей силой для частичного втягивания полярных и даже заряженных групп в липидный бислой. Однако для переноса ионизированных и полярных групп из водного окружения в липидный бислой необходимо большее количество свободной энергии, н вряд ли модель спонтанного встраивания будет применима всегда, поскольку при сборке многих мембранных белков необходимо транспортировать через мембрану длинные, часто сильно заряженные полнпептидные цепи.
Тем не менее было показано, что некоторые небольшие мембранные белки включаются в лнпидные бислон спонтанно. К ним относятся цитохром Ь$ с единственным гидрофобным якорем на С-конце и пробелок оболочки бактериофага М13, предположительно содержащий две трансмембранные спирали, которые, возможно, и встраиваются в бислой с образованием спиральной шпильки или петли. Пробелок оболочки содержит сигнальную последовательность из 23 остатков, обычно отщепляемую при сборке в цитоплазматической мембране Е. coli. Зрелый белок имеет кислый N-конец, обращенный в периплазматическое пространство, трансмембранный сегмент и основный С-конец, обращенный в цитоплазму. Он спонтанно встраивается в фосфолипидные липосомы, причем скорость его сборки in vivo сильно замедляется, если в трансмембранном участке или на С-конце зрелого белка имеются мутации, что согласуется с моделью, в рамках которой два гидрофобных сегмента могут спонтанно встраиваться в липидный бислой в виде шпильки или петли. На рис. 10.9 представлена схема встраивания этого белка в мембрану. Интересно, что сборка пробелка оболочки вируса М13 может осуществляться и с помощью микросом млекопитающих, причем этот процесс требует АТР, воз
можно, для поддержания необходимой для транспорта конформации. Следует отметить, что этот белок не типичен для белков, сборка которых осуществляется на плазматической мембране £. coli, поскольку он имеет отщепляемую сигнальную последовательность, и его сборка происходит независимо от функций генов secA, secY, необходимых для переноса белков внутрь плазматической мембраны или через нее.
Результаты исследования пробелка оболочки бактериофага М13 убедительно проиллюстрировали справедливость механизма самопроизвольного встраивания белков в мембрану без участия белков-посредников. Предполагается, что водорастворимый предшественник приобретает конформацию, обеспечивающую встраивание его в мембрану, при взаимодействии с бислоем. Эта обобщенная модель была предложена как часть «мембранной триггерной гипотезы». Сходный механизм был предложен для сборки по крайней мере каких-то участков более сложных мембранных белков, например переносчика глюкозы. Заметим, что механизмы самопроизвольного встраивания путем образования петли или спиральной шпильки могут рассматриваться только в тех случаях, когда нет тесного сопряжения между мембранным переносом и трансляцией.
Еще один пример, иллюстрирующий важную роль самопроизвольного встраивания в липидный бислой при переносе, — это апо-цитохром с, предшественник митохоидриальиого цитохрома с. Ои ие отличается по длине от зрелого цитохрома с, но лишен ковалентно связанного гема с, который присоединяется к молекуле только после переноса белка через наружную митохондриальную мембрану. Зрелый белок содержится в межмембранном пространстве митохондрий. Показано, что апоцитохром с, связываясь с анионными липидами в фосфолипидных везикулах, может проникать в липидный бислой и пересекать его. Механизм такой замечательной активности до конца неизвестен; возможно, при этом происходит существенная перегруппировка липидов. Удивительно, что в этом полипептиде нет протяженных гидрофобных участков и 40% аминокислотных остатков заряжены!
Применимы ли данные, полученные на искусственных фосфоли-пидных везикулах, к системам in vivo, неясно, но, согласно одной из моделей, апоцитохром с должен проникнуть в наружную мембрану достаточно глубоко для того, чтобы он мог связаться со специфическим белковым рецептором на внутренней поверхности мембраны. Впрочем, при этом не исключается наличие канала. In vivo ковалентное присоединение гема удерживает зрелый белок в межмембранном пространстве и, возможно, приводит к конфор-мационным изменениям, необходимым для дальнейшего переноса.
К самопроизвольному встраиванию в липидные бислой и биомембраны способны и многие другие водорастворимые белки, хотя механизм такого встраивания остается неизвестным. Основными представителями являются токсины и белки, образующие поры. Все построенные модели обычно предполагают, что в белке происходят конформационные изменения, в результате которых гидрофобные остатки, упрятанные внутри водорастворимой структуры, экспонируются в липидный бислой при включении в него белка. Примерами такого рода служат а-токсин из Staphylococcus aureus, компонент комплемента С9 и ко-лицин А. Во многих случаях для инициации конформационно-го перехода необходимо понизить рН. Вряд ли эти токсины и белки, образующие поры, могут служить модельными системами, пригодными для изучения сборки многих мембранных белков. Однако они четко показывают, что водорастворимые предшественники действительно могут самопроизвольно укладываться внутри бислоя, образуя сложные трансмембранные биохимически активные зрелые формы.
Таким образом, если речь идет о переносе линейно вытянутого полнпептида, то при энергетических расчетах необходимо основываться на наличии поры, заполненной водой, или канала, способного обеспечить гидрофильное окружение для заряженных или полярных групп. Эта модель приемлема для большинства белков, хотя имеются многочисленные примеры, когда происходит самопроизвольное включение отдельных спиралей или доменов в липидный бислой. Если специфические каналы для переноса белков действительно существуют, они должны быть очень хитро устроены, поскольку через них проходят практически любые полипептнды и задерживаются ионы и небольшие метаболиты. Исследование таких пор методом пэтч-клампа не проводилось.
5. ПОЛИПЕПТИДНЫЕ СИГНАЛЫ, ОТВЕЧАЮЩИЕ ЗА СОРТИРОВКУ БЕЛКОВ И ВСТРАИВАНИЕ ИХ В МЕМБРАНЫ
Об аппарате и механизме переноса мы не знаем почти ничего; немного больше известно о сигнальных последовательностях, присутствующих в полипептидах и направляющих каждый белок в нужное место. Успехов в этой области удалось достичь благодаря использованию техники рекомбинантных ДНК. С ее помощью были сконструированы гибридные полипептиды, в которые была включена тестируемая аминокислотная последовательность, принадлежащая другому белку. Таким образом можно было изучать влияние предполагаемой сигнальной последовательности на локализацию «белка-пассажира». Преимущества такого подхода удается использовать только в том случае, если вся информация, определяющая локализацию конечного продукта, заключена в первичной последовательности сигнала и если «белок-пассажир» является нейтральным участником процесса и, что существенно, подчиняется сигналу. Это условие выполняется во многих случаях, но известны и таки?