Реферат: Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия
Часто наряду с фу применяется время вращательной релаксации ф, = 1/. Для белковой молекулы радиусом 25 А, находящейся в мембране толщиной 40 А и вязкостью 5 пуаз, величина ф, по оценкам составляет около 35 мкс. С количественной точки зрения это уравнение, описывающее вращение белка в бислое, не вполне строго, но зависимость времени вращательной релаксации от эффективного радиуса вращающейся белковой молекулы сомнений не вызывает. Это оказалось весьма полезным для исследования процессов агрегации белков внутри мембраны. Методы, применяемые для изучения вращения белков в бислое, должны быть способны регистрировать времена вращения от 10"5 до 10 ~3 с. Обычный метод измерения деполяризации флуоресценции в этом случае непригоден, поскольку время жизни молекул в возбужденном состоянии составляет около 10"8 с, и в таком временном масштабе молекулы белков представляются неподвижными. Успешно использовались три метода.
1. К исследуемому белку присоединяют зонд, время жизни которого в возбужденном триплетном состоянии достаточно велико. Если метка жестко связана с белком, то для регистрации вращения белка можно использовать измерение анизотропии фосфоресценции. Для таких измерений оказались пригодными производные эозина, поскольку время жизни эозина в триплетном состоянии составляет примерно 2 мс. В основе этого подхода лежат те же принципы, что и в основе метода деполяризации флуоресценции, но используется другая молекулярная модель движения, вызывающего деполяризацию. Эксперимент состоит в определении характерного времени затухания анизотропии фосфоресценции. Если система гетерогенна, могут возникнуть определенные трудности, связанные с количественным анализом экспоненциальной кривой затухания анизотропии. Проблемы возникают и в тех случаях, если метка может локально вращаться на поверхности мембранного белка или если у белковой молекулы имеются гибкие сегменты.
Те же метки могут использоваться и для анализа вращения белков с использованием временной зависимости дихроизма поглощения. В этом случае изменения в ориентации дипольного момента перехода регистрируются по поглощению света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси поляризации начального импульса, используемого для возбуждения молекул.
2.Известны случаи, когда сами молекулы белка содержат группы, переходящие при флеш-фотолизе в долгоживущее возбужденное состояние, параметры которого можно оценить с помощью дихроизма поглощения. В качестве примера можно привести родопсин и бактериородопсин, где используются возбужденное состояние связанного ретиналя и возбужденные состояния, наблюдающиеся при фотолизе комплексов цитохром—СО с использованием цитохром с-оксидазы и цитохрома Р450. Измерения можно проводить insituили с очищенным белком, встроенным в фосфолипидные везикулы.
3.С помощью обычной ЭПР-спектроскопии не удается регистрировать вращения, характерная частота которых равна частоте вращения мембранных белков. Однако разработан специальный метод — ЭПР с переносом насыщения, диапазон чувствительности которого очень широк — от 10"7 до 10 ~J с. Этот метод применялся при изучении вращения нескольких мембранных белков с ковалентно пришитыми к ним спиновыми метками. Недостаток метода состоит в том, что в случае анизотропного молекулярного движения спектры с трудом поддаются интерпретации.
3.1 Примеры вращения белков
Внутримембранные белки характеризуются широким спектром времен вращательной релаксации. На одном конце временной шкалы находится родопсин, который, по-видимому, свободно вращается в мембране наружного сегмента палочки сетчатки, а на другом — бактериородописин, который образует в пурпурной мембране упорядоченную кристаллическую решетку и неподвижен. Для нескольких очищенных белков, встроенных в фосфолипидные везикулы, зависит от концентрации. Это позволяет предположить, что при уменьшении соотношения липид/белок происходит самоагрегация этих белков. Такая картина характерна для бактериородопсина, цитохром с-оксидазы, белка полосы 3, Са2 + -АТРазы и цитохрома Р450. Возможно, именно с самоагрегацией связана гетерогенность, наблюдаемая, в частности, для белка полосы 3 в тенях эритроцитов и Са2 + -АТРазы из саркоплазматического ретикулума. Вообще говоря, мембранные белки, по-видимому, вращаются в плоскости мембраны и скорость вращения согласуется с величиной, ожидаемой исходя из простой гидродинамической модели.
Дополнение. Вращение белка полосы 3 и цитохрома Р450: выявление межмолекулярных взаимодействий
Из двух указанных белков — белка полосы 3 и цитохрома Р450 — наибольший интерес представляет первый, поскольку по имеющимся биохимическим данным можно предположить, что этот анионный переносчик связан со спектрино-актиновой сетью цитоскелета. Обнаружение того факта, что значительная часть белковых молекул способна к быстрому вращению, послужило основанием для создания моделей, согласно которым белок полосы 3 иммобилизован не полностью или образует со спектрином временную связь. Однако ситуация осложнялась тем, что при лизисе клеток, необходимом для получения теней эритроцитов, комплекс с цитоскелетом может разрушаться. В интактной клетке белок полосы 3 совершает только медленные вращательные движения с характерным временем 0,1 — 1 мс. Это больше согласуется с отсутствием поступательного движения белка полосы 3, хотя физическая причина такого ограничения подвижности не установлена.
Цитохром Р450 акцептирует электроны от цитохром Р450-редук-тазы в электронтранспортной цепи микросом. Многих ученых интересовал вопрос: образуют ли эти молекулы долгоживущий комплекс в мембране или их взаимодействие сводится к простым столкновениям в результате диффузии? При низком соотношении липид/белок цитохром Р450 агрегирует и вращение его замедляется. Однако в присутствии стехиометрических количеств редуктазы цитохром Р450 в сходных условиях остается мобильным. Это свидетельствует о взаимодействии двух указанных белков и образовании комплекса между ними со стехиометрией 1:1, которое препятствует агрегации Р450.
4. Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах
Способность мембранных компонентов к латеральной диффузии — это одно из очевидных условий, принятых в жидкостно-мозаичной модели. Для измерения коэффициента латеральной диффузии применялось несколько методов. Рассмотрим три из них.
1.Осуществляют слияние клеток, несущих на своей поверхности различные маркеры, с образованием гетерокарионов. После слияния оценивают скорость перераспределения поверхностных маркеров с помощью флуоресцентной микроскопии и с использованием меченных различными флуоресцентными метками антител против специфических поверхностных антигенов.
2.Осуществляют перераспределение мембранных белков с помощью электрофореза insitu. При внесении клеток в электрическое поле белки концентрируются в одной части мембраны, и коэффициент латеральной диффузии определяют по данным о скорости их перераспределения после отключения электрического поля. За перераспределением белков можно наблюдать с помощью электронной микроскопии или флуоресцентных методов.
3.Чаще всего используется метод, основанный на восстановлении способности белков к флуоресценции после фотообесцвечивания. Суть метода представлена на рис. 5.6. С помощью мощного лазерного луча обесцвечивают пятно диаметром - 1 мкм на равномерно меченной с помощью флуоресцентной метки мембране. Далее исследуют кинетику разгорания флуоресценции этого участка и по скорости восстановления флуоресценции прямо оценивают скорость латеральной диффузии флуоресцентных зондов на обесцвеченный участок из областей мембраны, прилегающих к нему. С помощью этого метода можно исследовать амфифильные флуоресцентные зонды, меченые фосфолипиды и белки, несущие флуоресцентные метки. Структурные формулы некоторых наиболее часто используемых зондов приведены в табл. 5.1. Можно ожидать, что применение видеотехники для изучения перераспределения флуоресцентных молекул в мембране расширит рамки применения этого метода. Использование двух первых методов сопровождается значительными нарушениями клеток или мембран. Метод FRAP является более щадящим. Опасения, связанные с возможностью повреждений клеток лазерным лучом, были сняты. Метод можно также применять для исследования модельных мембранных бислоев и монослоев, а также интактных клеток или фрагментов биомембран. Фокусируя лазерный луч диаметром ~ 1 мкм в разных точках, можно наблюдать за датеральной диффузией мембранных компонентов в различных участках мембраны.
Коэффициенты поступательной диффузии, которые можно определить с помощью этого метода, варьируют от Ю-7 до 10 ~12 см2 /с. Коэффициент диффузии 10 "12 см2 /с в рамках этого подхода соответствует отсутствию движения. Значение D = 10 "8 см2 /с, характерное для липидов в биомембранах, отвечает диффузии на расстояние около 2 мкм за 1 с.
4.1 Модели, описывающие латеральную диффузию
Для описания поступательной диффузии мембранных белков часто применяется гидродинамическая модель Саффмана и Дельбрюка. В этой модели рассматривается диффузия белка в тонком вязком слое; при этом считается, что растворитель является сплошной средой, т. е. молекулы растворителя малы по сравнению с диффундирующими молекулами. В рамках этой модели выполняется следующее соотношение:
где т)м и 1), — вязкости мембранной и водной фаз соответственно, а — радиус белковой молекулы, имеющей форму цилиндра, h — толщина мембраны. Из модели следует, что скорость поступательной диффузии слабо зависит от размера молекулы, что подтверждается полученными к настоящему времени экспериментальными данными.
Эта гидродинамическая модель не позволяет описывать диффузию липидных зондов, поскольку к ним неприменимо допущение о том, что белок диффундирует в сплошной среде. Для объяснения поведения липидов применялись различные модели, основанные на концепции свободного объема. В рамках этих моделей диффузия рассматривается как процесс движения молекул в полостях, образующихся вследствие спонтанных флуктуации, при этом определяющей характеристикой мембран является отношение площади, приходящейся на одну молекулу липида, к минимальной Удельной площади, соответствующей максимально плотной упаковке липидов, т. е. плотность упаковки липидов. Как мы уже от?