Реферат: Энергетические вещества тканей почки
2.1. Методы и материал исследования.
Исследования тканей почки проводились на половозрелых 7 месячных белых крысах генетической линии Вистар женского пола(2шт.) и мужского (1 шт.) (табл.1).
Табл.1 Материал исследования
| № п/п | Масса животного, г | Масса почки, г |
| 1 | 234,0 ±9,8 | 1,05±0,08 |
| 2 | 249,7±9,8 | 0,76±0,08 |
| 3 | 214,9±9,8 | 0,70±0,08 |
| Среднее значение | 232,9 | 0,84 |
Метод 1. Определение глюкозы.
Глюкоза определялась редуктометрическим феррицианидным методом. Принцип метода состоит в следующем: белки ткани осаждаются гидроксидом кадмия. Глюкоза, содержащаяся в безбелковом фильтрате, окисляется в щелочной среде феррицианидом калия (красная кровяная соль), избыток которого определяется иодометрически. Образовавшийся ферроцианид калия связывается сернокислым цинком, который входит в состав “тройного раствора”[6].
Метод 2. Определение гликогена.
Стадия 1. Выделение гликогена. Принцип метода заключается в следующем: ткань подвергается десмолизу в 30%‑м гидроксиде калия (заменять на гидроксид натрия нельзя, так как при этом образуются плохо растворимые в спирте натриевые мыла и сода – это затрудняет последующую очистку осадка гликогена). Из десмолизата гликоген осаждается спиртом.
Стадия 2. Осаждённый гликоген подвергается гидролизу, и образовавшаяся глюкоза определяется редуктометрическим феррицианидным методом (метод 1) [6].
Метод 3. Совместное определение пирувата и лактата.
Стадия 1. Построение калибровочного графика для определения пирувата. Составляется ряд стандартных растворов пирувата (включая контроль – С=0). Строится график зависимости оптической плотности растворов от концентрации пирувата в растворах.
Стадия 2. Построение калибровочного графика для определения лактата. Составляется ряд стандартных растворов лактата (включая контроль – С=0). Строится график зависимости оптической плотности растворов от концентрации лактата в растворах.
Стадия 3. Определение количества пирувата в тканях почки колориметрическим методом с 2,4‑динитрофенилгидразином (по Умбрайту). Принцип метода состоит в том, что пируват взаимодействует в кислой среде с 2,4‑динитрофенилгидразином. Образующийся в результате реакции 2,4‑динитрофенилгидразид пировиноградной кислоты в отличие от гидразидов других кетокислот хорошо растворим в толуоле, при помощи которого его экстрагируют из реакционной смеси и создают щелочную среду, в которой он приобретает коричнево‑красную окраску. Определение проводят колориметрически.
Стадия 4. Определение количества лактата в тканях почки методом с использованием п‑оксидифенила (по Баркеру и Саммерсону). Принцип метода. Молочная кислота кипячением с конц. серной кислотой превращается в ацетальдегид, который при конденсации с п‑оксидифенилом образует 1,1‑ди‑(оксидифенил)‑этан. Этот продукт конденсации в растворе серной кислоты окисляется в продукт фиолетового цвета. Серная кислота действует здесь как конденсирующий агент и окислитель. Интенсивность окраски пропорциональна количеству ацетальдегида, а, следовательно, и количеству лактата. Метод позволяет определять лактат в количествах от 0,03 до 0,2 мкмоль (2,7 – 18,0 мкг) в пробе.
2.2. Результаты и их обсуждение
При проведении эксперимента были получены следующие результаты (табл.2):
Табл.2 Содержание метаболитов в тканях почки в мг%.
| Метаболит | Содержание метаболита | |
| экспериментальное | литературное | |
| глюкоза | 27,9±1,6 | 54±6 [7] |
| гликоген | 48,1±2,2 | 50,4±3,5 [8] |
| лактат | 35,95 | 32,4±1,8 [9] |
| пируват | 1,93±0,19 | 2,64±0,1 [10] |
Приведём калибровочные графики для определения содержания пирувата и лактата:
В источнике [7] содержание глюкозы в тканях почки определялось о‑толуидиновым методом, сущность которого заключается в ферментативном окислении глюкозы до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода, которая затем определялась с помощью о‑толуидина. Этот метод более специфичен для определения глюкозы чем феррицианидный, так как исключает практически все побочные процессы.
В источнике [8] для определения гликогена ткани почек для исследования брали прижизненно под местной новокаиновой анестезией. Количество общего гликогена определяли по методу Пфлюгера. Количество истинной глюкозы определяли по методу Нельсона. Эти методы более специфичны. Этим можно объяснить расхождение в результатах по гликогену.
В источнике [10] в основу определения пирувата положен ферментативный метод. Он основан на непрямом определении количества оксалоацетата, синтезируемого в ходе ферментативной реакции из пирувата и двуокиси углерода по окислению НАДН в присутствии избытка малатдегидрогеназы. Убыль НАДН регистрировали спектрофотометрически. Этим можно объяснить расхождение в результатах по пирувату, так как метод более специфичен. Вид калибровочного графика позволяет говорить о систематической ошибке, однако, расхождение в литературных и экспериментальных данных невелико.
В источнике [9] в основу определения содержания лактата положен метод Хохорста. Принцип метода. В присутствие лактатдегидрогеназы лактат переходит в пируват, причём связывание образуется в ходе реакции пирувата с гидразин-глициновым буфером, что способствует полному окислению лактата.
Образовавшееся количество НАДН эквимолярно количеству окисленного лактата. Регистрацию проводили спектрофотометрически.
Выводы
В ходе экспериментальной работы были получены результаты, которые были сопоставлены с литературными данными. К сожалению, не удалось найти статьи, в которой был бы использован феррицианидный метод (во всех работах использовались разнообразные ферментативные методы), а также не во всех работах использовались крысы – линии Вистар (в источнике [7] опыты проводились на беспородных крысах обоих полов). Поэтому, литературные данные могут быть не достаточно точными по отношению к данной линии. Однако, результаты, полученные в опытах, в основном совпали с литературными данными, кроме глюкозы. По-видимому в опыте с определением глюкозы в почке была допущена грубейшая ошибка. Но результаты можно считать, на мой взгляд, приемлемыми.
Список использованной литературы:
1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., Биологическая химия – М., Медицина, 1998 г.
2. Физиология человека /Под ред. Смирнова В.М./ – М., Медицина,2001 г.
3. Общий курс физиологии человека и животных /Под ред. Ноздрачёва А.Д./ – М., Высшая школа, 1991 г.