Реферат: Епізоотологічні особливості грипу птахів в Україні

ФДУ “ЦНДІЕ”, Москва

(Росія)

22.02.06 – 11.03.06 м. Одеса, зоопарк VLA Вейбрідж (Англія) 03.05.06 – 21.05.06

Херсонська область

(оз. Сиваш)

VLA Вейбрідж (Англія) 10.06.06 – 16.07.06 Сумська область VLA Вейбрідж (Англія)

Подальші спалахи ВППГ (до 16.07.2006 р.) серед приватних та диких птахів у Одеській, Херсонській, Сумській областях, а також у м. Феодосія, діагноз хвороби яких контролювався референтними лабораторіями, засвідчив про циркуляцію раніше виділеного штаму “А/chiken/Crimea/1/2005 (H₅ N₁ )”.

Молекулярно-генетичними дослідженнями не було виявлено мутантів цього штаму вірусу, які містили б комплементарні до епітелію людини рецептори, а також тих, що були резистентні до лікувальних препаратів (ремантодину, амантодину та озельтамівіру).

Одержані дані дозволили створити карту-схему поширення високопатогенного грипу птахів територією України за період 2005–2006 рр. (рис. 1).

На карті зазначені епізоотичні вогнища високопатогенного пташиного грипу, які були виявлені в АР Крим, Одеській, Херсонській та Сумській областях.

Молекулярно-генетичний аналіз вірусу пташиного грипу, виділеного із системи оз. Сиваш. У листопаді 2006 – квітні 2007 року нами були здійснені експедиційні виїзди та відбір проб матеріалу (мотиль, мул, креветки, пеленгас) з місць, де спостерігалось захворювання диких птахів у травні 2006 року. Вищезазначені проби досліджували у ПЛР у реальному часі і проби, у яких ПЛР давала позитивний результат, були використані для зараження та проведення трьох пасажів на курячих ембріонах. Результати проведених досліджень матеріалу на наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу А H₅ N₁ наведені в табл. 2. З неї видно, що спостерігалась загибель курячих ембріонів, які були заражені пробами патологічного матеріалу від мотиля, алантоїсна рідина яких виявилась позитивною в ПЛР (А/H₅ N₁ ). При дослідженні в ПЛР позитивними також виявились проби зразків із пеленгаса та мулу, а проби із креветок дали негативний результат.

Фрагменти ПЛР позитивного зразка від мотиля клонували у плазмідний вектор та визначали їх нуклеотидну послідовність. На підставі трьох сіквенсів ізоляту пташиного грипу був проведений філогенетичний аналіз. У подальшому, використовуючи веб-браузер BLAST-P, проведено пошук по базах даних GenBank, EMBL, BDBI та PDB, найбільш споріднених до визначеного нами фрагмента вірусу пташиного грипу, амінокислотних послідовностей інших ізолятів вірусу.

Таблиця 2 – Дослідження матеріалу із ставів оз. Сиваш на наявність вірусу високопатогенного грипу H ₅ N ₁

№ п/п	Характеристика проби	Методи дослідження
		титр у РГА	титр у РЗГА (Н5)	ПЛР в режимі реального часу, A/H5 N1	зараження курячих ембріонів 10-добового віку
1	Проба мотиля, листопад, 2006 рік	НД	НД	+
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 3 ембріони	1:256	1:64	+	Загибель на 3 добу
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІ пасаж, 5 ембріонів	1:256	1:64	+	Загибель на 3 добу
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІІ пасаж, 5 ембріонів	1:256	1:64	+	Загибель на 3 добу
2	Проба мотиля, квітень, 2007 рік	–	НД	+	Загибель не відбулась
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 7 ембріонів	–	НД	–	Загибель не відбулась
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІ пасаж, 5 ембріонів	–	НД	–	Загибель не відбулась
	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – ІІІ пасаж, 5 ембріонів	НД	НД	–	Загибель не відбулась
3	Проби мулу, став Любимівка, оз. Сиваш	–	НД	+
4	Алантоїсна рідина курячих ембріонів – І пасаж, 5 ембріонів	–	НД	–	Загибель не відбулась
5	Проби пеленгаса, став Костин Шпиль, оз. Сиваш	–	НД	+	Загибель не відбулась
6	Проби креветок, став Костин Шпиль, оз. Сиваш	НД	НД	–

Примітки: 1. У цій та наступних таблицях: (+) – позитивний результат дослідження; (–) – негативний результат дослідження;

2. НД – матеріал не досліджували.

На підставі одержаних результатів були побудовані філогенетичні дерева і встановлено наявність нового ізоляту штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅ N₁ )”. З’ясувалось, що цитопатична дія нового штаму (визначали шляхом зараження моношарових культур фібробластів ембріонів курей) проявлялась через 48 годин та завершувалась впродовж 72-х годин. Титр вірусовмістимої рідини штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅ N₁ )” на культурі курячих фібробластів становив 10^5,9 ЦПД _50/0,1см ³ , а на курячих ембріонах − 10^8,45 ЕЛД _50/0,1см ³ .

Зміни гістоструктури курячих ембріонів, заражених вірусом грипу штаму “А(chironomida)Azov/11/2006/(H₅ N₁ )”. Встановлено, що виділений нами штам “А(chironomida)Asov/11/2006 /(H₅ N₁ )” у трьох проведених пасажах на курячих ембріонах проявляє цитопатогенну дію і зумовлює загибель ембріонів через 48 годин. Патогенна дія у ембріонів проявляється ураженнями головного та спинного мозку, мозкових оболонок, що формуються, та ендотелію кровоносних судин, які мають запальний характер. Також відмічається розвиток жирової дистрофії гепатоцитів та зернистої дистрофії нефроцитів.

Одержані результати прояву патогенної дії підтверджують належність цього штаму до високопатогенного вірусу грипу птахів.

Морфофункціональні зміни в організмі риб, заражених вірусом грипу штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅ N₁ )”. Після введення коропам у черевну порожнину вірусовмістимого матеріалу, відібраного від мотиля, впродовж всього досліду загибелі риб не реєстрували, а також були відсутні клінічні та патолого-анатомічні ознаки захворювання (табл. 3).

Таблиця 3 – Виявлення присутності вірусу та визначення вірусної активності в гомогенатах тіла коропів

Строки відбору проб, діб	Кількість введеного вірусовмістимого матеріалу, см3	Методи дослідження				Результати інфікування курячих ембріонів
		РГА	РЗГА	ПЛР
Через 1	0,1	+	+	+	Загибель на 3 добу
	0,2	+	+	+
Через 2	0,1	–	–	+	Загибель на 3 добу
	0,2	+	+	+
Через 3	0,1	–	–	+	Загибель на 3 добу
	0,2	–	–	+
Через 5	0,1	–	–	–	Загибель відсутня
	0,2	–	–	–
Через 10	0,1	–	–	–	Загибель відсутня
	0,2	–	–	–

Зразками гомогенатів від позитивних у ПЛР риб були заражені 10-добові курячі ембріони. Загибель курячих ембріонів реєструвалась через 3 доби. Після утримання інфікованих риб і подальшому відборі з них через 5−10 діб патологічного матеріалу та його інокуляції не відмічали загибелі ембріонів, і не було встановлено наявність вірусу за допомогою ПЛР. Як видно з табл. 3, в організмі коропа патогенний вірус грипу птахів зберігався протягом 3-х діб.

За період проведення експериментів (10 діб) не спостерігалось достовірного зниження маси, довжини, вгодованості, морфологічних та біохімічних показників крові (еритроцити, лейкоцити, вміст білка та лізоциму в сироватці) в дослідних групах риб порівняно з ?