Реферат: Факторы роста и выживание нейронов

Развивающиеся нейроны для своего выживания нуждаются в определенных белках, называемых факторами роста. Первым из факторов роста был идентифицирован фактор роста нерва (ФРН, NGF). В своих пионерских работах Леви-Монтальчини, Кохен с коллегами первыми показали, что ФРН стимулирует рост отростков сенсорных и симпатических нейронов. Позднее они показали, что ФРН необходим также для выживания нейронов. Блокирование действия ФРН у новорожденных мышат при помощи антител вело к гибели симпатических нейронов. При этом парасимпатическая система не поражалась, и спинномозговые ганглии были только немного меньше, чем в норме. В последующих экспериментах было показано, что на более ранней стадии развития ганглию также необходим ФРН для выживания и эти нейроны не выживали, если антитела вводились до рождения (путем иммунизации матери). У взрослых животных антитела к ФРН были гораздо менее эффективны в обоих популяциях клеток. Нуль-мутации ФРН и его высокоаффинного рецептора (что обсуждается ниже в этой главе) у трансгенных мышей также подтверждают, что симпатическим и сенсорным нейронам необходим ФРН для выживания. Таким образом, как симпатические, так и сенсорные нейроны имеют критический период своего развития, выживание в который зависит от наличия ФРН.

Захват и ретроградный транспорт ФРН

То, что от ФРН зависит выживание нейрона, говорит о том, что его действие происходит в теле клетки. Симпатические нейроны выращивают в специальных камерах, состоящих из трех отсеков (рис. 1). В центральном отсеке, куда помешаются нейроны, должен находиться ФРН, иначе нейроны гибнут. Однако, как только отростки нейрона достигают боковых отсеков камеры, ФРН может быть удален из центрального отсека и клетки остаются живыми, при условии, что в боковых отсеках ФРН остается (рис. 1В). Это дает основания полагать, что трофические эффекты ФРН на развивающиеся нейроны могут передаваться в виде ретроградного транспорта ФРН от нервных терминалей в тела клеток. Исследования, проведенные на взрослых животных с радиоактивно меченым ФРН, показали, что он активно захватывается в нервные терминали и активно транспортируется ретроградно в сому. Взрослым нейронам ФРН не нужен для выживания, однако он регулирует, среди всего прочего, синтез адреналина, индуцируя образование двух ферментов, необходимых для его синтеза: тирозингидроксилазу и дофамин гидроксилазу. При повреждении транспорта ФРН взрослого нейрона уровень этих ферментов падает.

Рис. 1. Фактор роста нерва и выживание веточек аксонов клеток симпатических ганглиев, растущих в культуре клеток. (А) Нейроны, полученные из неонатального симпатического ганглия и помещенные в центральную секцию, посылают свои отростки под тефлоновым разделителем и в соседние секции; все секции содержат ФРН. (В) После начального роста отростков удаление ФРН из центральной секции в течение 20 дней не приводит ни к какому эффекту; нейроны в центральной секции используют ФРН, который ретроградно транспортируется из их терминалей, расположенных в боковых секциях. (С) После начального роста отростков удаление ФРН из левой секции вызывает дегенерацию нервных отростков в этой области,а те, которые находились в секции, содержащей ФРН, остаются интактными (Из Campenot, 1982.)

Факторы роста семейства нейротрофинов

Наблюдения, описанные в предыдущем разделе, привели к анализу молекулярных механизмов действия факторов роста большим количеством исследовательских групп, включая группы Леви-Монтальчини, Шутера, Тоенена и Барде⁾ . Они изучали такие вопросы, как свойства ФРН, рецепторов на мембране, которые связываются с ФРН, и последующие метаболические события. В слюнной железе ФРН присутствует в виде комплекса, состоящего из трех субъединиц. Ответственной за выживание нейрона и его рост является субъединица; она состоит их двух одинаковых белковых цепей, каждая из которых содержит 118 аминокислот и 3 дисульфидных мостика.

Сенсорные нейроны не только иннервируют свои мишени на периферии, но также направляют свои аксоны в ЦНС. Естественным является вопрос: существуют ли факторы, подобные ФРН, в ЦНС? В самом деле, в экстракте из ЦНС был обнаружен протеин, названный мозговым нейротрофическим фактором (МНФ, brain-derived neurotrophic factor, BDNF), который способствует выживанию нейронов дорзального спинного ганглия (ДСГ) в культуре и спасает их от гибели, если вводится in vivo эмбрионам во время периодов естественной гибели нейронов. Очистка и описание свойств МНФ выявили, что он имеет высокую степень гомологии с ФРН, показывая, что ФРН и МНФ являются членами одного семейства ростовых факторов, которое было названо нейротрофинами. Молекулярногенетические эксперименты помогли выявить еще несколько нейротрофинов: NT-3, NT-4/5 и NT-6. Все они состоят из димеров небольших основных белков, соединенных друг с другом при помощи бисульфидных связей между остатками цистеина. Димеры выглядят как симметричные белки с различными основными регионами, которые определяют свойства рецептора при встраивании его в мембрану (рис. 2).

На ранних периодах развития, до того, как произойдет иннервация периферических мишеней сенсорными нейронами, клеткам нервного гребня и сенсорным нейронам в ДСГ и ганглии тройничного нерва необходимы МНФ и NT-3 для пролиферации, дифференцировки и выживания. На таких ранних стадиях нейротрофины, по-видимому, секретируются самими нейронами, либо мезенхимальными тканями, расположенными вдоль роста аксонов сенсорных нейронов. В более поздние периоды, после того, как аксоны достигают своих целей, сенсорные нейроны начинают экспрессировать рецепторы к ФРН и становятся зависимыми от ФРН, секретируемого их мишенями.

Нейротрофины в ЦНС

Особенный интерес представляет нахождение популяции клеток, чувствительной к ФРН, в ЦНС. Таковыми являются холинергические нейроны, которые расположены в базальной области переднего мозга и которые иннервируют несколько различных структур, в том числе гиппокамп — область ЦНС, которая, как считают, связана с процессами памяти и обучения. Если аксоны этих нейронов у взрослой крысы перерезать, то клетки погибают. Однако, если после перерезания вводить в ЦНС ФРН, то клетки выживают после аксотомии. Число этих клеток, которые окрашиваются маркерами холинергических нейронов, уменьшается с возрастом, вместе со способностью крыс запоминать лабиринт и выполнять другие пространственные задачи. Если ФРН вводится взрослым крысам, число клеток, которые окрашиваются, увеличивается и улучшается выполнение крысами пространственных задач. Эти наблюдения показывают, что выживание и рост нейронов в ЦНС, скорее всего, зависит от факторов, которые одинаковы или близки к тем, которые были идентифицированы для периферических нейронов. Полученные результаты позволяют предполагать, в терминах молекулярной биологии, возможные дефекты этих факторов, которые могут привести к нарушениям развития мозга, и возможные пути борьбы с этими дефектами.

МНФ и NT-3 широко распространены в ЦНС как во время развития, так и у взрослых. Клетки коры и гиппокампа, скорее всего, нуждаются в МНФ и NT-3 для выживания, хотя изменения в выживаемости клеток в ЦНС трудно проследить. МНФ, как было показано, влияет на рост и сложность ветвления аксонов и дендритов в развивающейся ЦНС. Анализ мышей с генетическим дефицитом представляет многообещающий подход к пониманию роли нейротрофинов в развивающейся нервной системе .

Нейротрофины также могут играть определенную роль и в ЦНС взрослых животных. Физиологическая активность вызывает экспрессию определенных нейротрофинов в разных областях ЦНС и в ответ на различные стимулы. В свою очередь, нейротрофины, как было показано, способны влиять на физиологическую активность, облегчая синаптическую передачу и увеличивая или уменьшая возбудимость нейронов посредством регуляции экспрессии ионных каналов.

Рецепторы к нейротрофинам

Нейротрофины взаимодействуют с двумя типами рецепторов на поверхности нейронов--мишеней (см. рис. 3). Все нейротрофины связываются с относительно одинаковой и низкой активностью (К_d = 10^{--9 М) с мембранным рецептором, который был первоначально описан как низкоаффинный быстрый рецептор ФРН, или p75NGFR} ; более правильно называть этот рецептор низкоаффинным рецептором к нейротрофинам, или p75^LNTR этот рецептор экспрессируется как в нейрональных, так и в ненейрональных клетках. Также существуют высокоаффинные (К_d = 10^{-11 М) рецепторы к нейротрофинам. Результаты биологических проб показывают, что эффекты нейротрофинов на выживание клеток и на рост отростков нервов обусловливаются высокоаффинными рецепторами.}

Хотя высокоаффинные рецепторы к ФРН обычно расположены только на нейронах, они были первоначально обнаружены в клетках карциномы толстой кишки человека, как часть продукта синтеза онкогена trk (онкогенами называют гены, которые управляют трансформацией клеток). Аналог онкогена trk, находящийся в нормальных клетках, кодирует белок с массой около 140 кДа, называемый pl40^prototrk или просто Trk. Структура белка Trk, предсказанная на основе его аминокислотной последовательности, состоит из внеклеточного домена, содержащего сайтдомен, кодирующий тирозинкиназу (рис. 3). Существуют по крайней мере три члена семейства про-онкогенов trk, каждый из которых является высокоаффинным рецептором для одного или нескольких нейротрофинов: TrkA — рецептор к ФРН и NT-6; TrkB, по видимому, является рецептором к МНФ и NT-4/5, a TrkC является рецептором к NT-3.

Связывание нейротрофинов с высокоактивными рецепторами приводит в первую очередь к увеличению фосфорилирования тирозина рецепторами. Это происходит вследствие аутофосфорилирования; вызванное лигандом образование рецепторного димера способствует приближению друг к другу внутриклеточных доменов тирозинкиназы каждого рецептора таким образом, что они фосфорилируют друг друга. Фосфорилирование рецептора Trk активирует четыре внутриклеточных сигнальных пути: фосфорилирование тирозина белка, названного SNT (suc-associated neurotrophic factor-induced tyrosine-phosphorylated target, связанная с suc и тирозин-фосфорилируемая в ответ на нейтрофические факторы мишень), фосфолипазу С, фосфоинозитол-3-киназу и каскад Ras-MAP киназы (рис. 4) .

Функция низкоаффинного рецептора, который не имеет внутриклеточных доменов, неизвестна. В некоторых клетках он может взаимодействовать с высокоаффинным рецептором во время связывания нейротрофинов. В других клетках, особенно в тех, в которых нет высокоаффинных рецепторов, он может управлять гибелью клеток или обеспечивать механизм ограниченной диффузии для установления высокой локальной концентрации нейтротрофинов, что необходимо для регенерации периферического нерва.

Конкурентные взаимодействия во время развития

После того как аксон достигает своих мишеней и образует синаптические связи, два процесса управляют паттерном иннервации. Одним является период гибели клеток, когда большое количество нейронов, которые установили синаптические связи, погибает. Вторым является уменьшение количества аксонов и синапсов, что сопровождается реорганизацией оставшихся связей, формирующих взрослый паттерн иннервации. Каждый из этих процессов регулируется конкуренцией за ограниченное количество факторов роста.

Гибель нейронов

Удивительной особенностью развития нервной системы является то, что многим ее нейронам суждено погибнуть во время развития. У беспозвоночных интенсивная гибель нейронов сопровождается стремительными изменениями, происходящими во время метаморфоза, и регулируется гормонами. Однако в развивающейся ЦНС как позвоночных, так и беспозвоночных гибель клеток происходит также и в отсутствие значительных морфологических изменений.

Эксперименты, выполненные Гамбургером и Леви-Монтальчини, впервые выявили запрограммированную гибель нейронов эмбрионов позвоночных, а также показали, что степень гибели клеток может зависеть от размеров ткани-мишени. Они показали, например, что в развивающейся конечности в то время, когда формируются первые синаптические связи с миофибриллами, от 40 до 70 % мотонейронов, которые послали аксоны в эту конечность, погибают. Имплантация дополнительной конечности уменьшает долю погибающих мотонейронов, а удаление одного из зачатков конечностей приводит к увеличению числа гибнущих клеток, что дает основания для предположения, что мотонейроны конкурируют за некие трофические вещества, выделяемые тканью-мишенью.

Рис. 3. Связывание димера фактора роста нервов с двумя TrkA рецепторами приводит к тому, что домен внутриклеточного белка тирозинкиназы каждого из TrkA рецепторов фосфорилирует остатки тирозина другого TrkA рецептора. Это запускает четыре внутриклеточных сигнальных каскада, которые приводят к росту и дифференцировке. Активация фосфоинозитол-3-киназы (PI 3-kinase) способствует удлинению отростков и их выживанию. Фосфорилирование тирозина SNT приводит к дифференцировке. Активация фосфолипазы C-γ (PLC-τ) стимулирует MAP киназы, которые индуцируют экспрессию генов, дифференцировку и рост как непосредственно, так и через фосфорилирование RSK. MAP киназа также активируется через сигнальный каскад, который включает связывание белков SHC, Grb-2, SOS и Ras, а также киназ Raf и МЕК. — S— Р0₄ — фосфорилирование серина; — Т — Р0₄ — фосфорилирование треонина; — Y — Р0₄ — фосфорилирование тирозина.

В самом деле, большое разнообразие нейротрофических белков, в основном вырабатываемых в мышце, как было обнаружено, могут управлять развитием мотонейронов: МНФ, NT-3 и NT-4/5, ИФР (инсулиноподобный фактор роста, IGF, insulin-like growth factor), CNTF (ciliary neurotrophic factor, нейротрофический фактор ресничек), GDNF (glial-derived neurotrophic factor, глиальный нейротрофический фактор), CDF (cholinergic differentiation factor, фактор холинергической дифференцировки, также называемый LIF, leukemia inhibitory factor, фактор подавляющий лейкемию) и ИФР-I (инсулиноподобный фактор роста 1). При введении их эмбриону эти белки предупреждают гибель мотонейронов, которые без этих факторов неминуемо погибли бы. Однако существует и несколько доказательств, включая анализ мутантных мышей, у которых отсутствует один или несколько подобных белков или их рецепторов, которые показывают, что ни один из этих факторов не является необходимым для выживания мотонейрона во время развития. Наилучшим кандидатом для фактора, регулирующего выживание мотонейрона, является еще пока неидентифицированный лиганд рецептора CNTF .

Избыточная продукция нейронов, после которой следует период гибели клеток, является характерной чертой развития нервной системы позвоночных. Некоторые из нейронов, которые погибают, возможно, не смогли образовать синапсов, или образовали их с неподходящей клеткой-мишенью. В подобных случаях гибель клеток связана с особенностью иннервации. Однако большинство клеток, которые гибнут, достигают и иннервируют правильные клетки-мишени. Таким образом, гибель клеток является основным механизмом, который поддерживает равновесие между количеством нейронов и их мишеней.

Неожиданной находкой явилось то, что ингибиторы образования мРНК или синтеза белка предотвращали гибель нейронов в отсутствие необходимых им нейротрофинов. Результаты этих и более поздних экспериментов показали, что гибель нейронов типично происходит путем апоптоза. Апоптоз — это процесс, который активирует внутреннюю «суицидальную» программу клетки, которая приводит к упорядоченному (запрограммированному) распаду ДНК и белков в клетке. Существенно, что для этого необходим предварительный синтез протеолитических ферментов или их активаторов.

Уменьшение числа связей и исчезновение полинейрональной иннервации

После того как популяция нейронов, иннервирующих определенную мишень, уменьшается благодаря гибели клеток, оставшиеся нейроны конкурируют друг с другом за синаптическую территорию. Это конкурирование обычно приводит к потере некоторых первично образованных веточек и синапсов («обрезка»). Уменьшение числа связей обеспечивает механизм для формирования правильной и полной иннервации мишени определенной популяцией нейронов. В некоторых случаях механизм уменьшения числа связей также обеспечивает механизмы коррекции ошибок; в других случаях он отражает стратегию поиска пути аксоном.

Особо яркий пример конкурентного уменьшения числа связей можно увидеть в развивающейся скелетной мышце. У взрослых животных каждый мотонейрон иннервирует группу до 300 мышечных волокон, формируя двигательную единицу , но каждое мышечное волокно иннервируется только одним аксоном. Однако в развивающейся мышце мотонейроны бурно ветвятся, так что каждое мышечное волокно в итоге иннервируется аксонами от нескольких мотонейронов (рис. 4), что называется полинейрональной иннервацией. В каждом развивающемся мышечном волокне синаптические окончания всех аксонов разбросаны вокруг одного участка, вблизи скоплений рецепторов АХ и других компонентов постсинаптического аппарата. По мере развития веточки аксонов исчезают, что приводит в конечном итоге к формированию взрослого паттерна. Этот процесс не вызывает гибель клетки (которая обычно происходит на более ранних стадиях развития), а только уменьшение количества мышечных волокон, иннервируемых каждым из мотонейронов.

Рис. 4. (Рис. 4В, 4D см. на цветной вклейке после с. 640.) Полинейрональная иннервация и ее исчезновение в нерв но мышечном соединении позвоночных. (А) Во время развития эмбриона веточки аксонов моторных нейронов иннервируют множество мышечных волокон, и каждое мышечное волокно иннервируется несколькими мотонейронами (полинейрональная иннервация). (В) Флуоресцентная микрограмма нервно-мышечного соединения мыши (стадия Е18), показывающая распределение терминалей двух аксонов, каждый из которых помечен при помощи липофильной метки. В период полинейрональной иннервации терминальные ветвления аксонов мотонейронов, иннервирующих определенное мышечное волокно, переплетаются в областях отдельных синапсов. (С) После рождения полинейрональная иннервация исчезает по мере того, как веточки аксонов подвергаются ретракции, в результате чего каждое мышечное волокно получает иннервацию только от одного мотонейрона. (D) Флуоресцентная микрофотография нервно-мышечного соединения мыши во время исчезновения полинейрональной иннервации. Два аксона, иннервирующих синапс, были помечены как в В. Все терминали одного аксона исчезли, и сам аксон подвергся ретракции.

Исчезновение полинейронной иннервации регулируется конкуренцией между аксонами различных мотонейронов за синаптическое пространство на мышечных клетках. Наиболее ярким примером являются эксперименты на развивающихся мышцах лапки крысы. Когда все кроме одного моторные аксоны, иннервирующие эту мышцу, были перерезаны на раннем этапе развития, оставшийся аксон подвергся ветвлению и начал иннервировать большое количество волокон данной мышцы. В то время, когда обычно происходит исчезновение полинейрональной иннервации, ни один синапс не исчез. В отсутствие конкуренции для выживания мотонейрон поддерживает контакты с каждой миофибриллой, которую он ранее иннервировал. В экспериментах Лихтмана с коллегами были получены яркие картинки этого процесса при помощи визуализирования нервных терминалеи у животных in vivo при помоши витальных красителей и наблюдения за изменениями синаптической структуры во время исчезновения синапсов. Подобная же ретракция избыточного количества связей была показана в автономном ганглии неонатальных крыс и морских свинок. Каждая ганглионарная клетка первоначально получает большое количество связей, больше пяти, однако к возрасту 5 недель из них обычно остается только одна.

Активность нервов и исчезновение синапсов

Физиологические эксперименты показывают, что активность нейронов играет определенную роль в исчезновении синапсов, влияя как на интенсивность, так и на и результат конкуренции между терминалями аксонов. Стимулирование мышцы через нерв при помощи имплантированных металлических электродов увеличивает интенсивность исчезновения синапсов. Уменьшение активности путем добавления тетродотоксина в пространство вокруг нерва для блокирования потенциалов действия приводит к ингибированию синаптической передачи и замедлению исчезновения синапсов. На мышцах, которые получают сигналы от аксонов двух различных нервов, возможно проведение интересных экспериментов по блокированию проведения импульсов избирательно в одном из нервов. В таких случаях неактивные нейроны не могут, очевидно, нормально конкурировать: аксоны блокированных нейронов иннервируют двигательных единиц меньше, чем в норме; аксоны активных нервов иннервируют волокон больше, чем обычно. Однако доминирование неблокированных нервных волокон не полное, что говорит о роли других факторов, кроме активности, в исчезновении синапсов.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--