Реферат: Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением

Например, если волновод изготовлен из кварца, а прозрачной средой является водный раствор, то, как следует из уравнения, угол в будет равен 67°. Если угол в равен 70°, а длина волны света 500 нм, то d_ составляет примерно 270 нм. Считается, что размер молекулы IgGсоставляет примерно 10 * 6 нм. Поэтому состоящий из трех слоев IgG иммунный комплекс на твердой поверхности должен иметь среднюю толщину около 25 нм. На расстоянии 25 нм от поверхности сила поля еще будет равна 91% Е₀ . Однако при увеличении этого расстояния в два или три раза, согласно закону экспоненциального затухания, сила поля уменьшится до 83% и 76% соответственно.

Глубина проникновения - это только один из четырех факторов, которые определяют ослабление интенсивности света, вызванное поглощением пленки при внутреннем отражении. Другими факторами являются; зависящая от поляризации интенсивность электрического поля на поверхности отражения; облучаемая площадь поверхности, возрастающая с увеличением в; соотношение показателей преломления двух сред, от которого зависит сила оптического взаимодействия. Соответствующий параметр, учитывающий все эти факторы, называют эффективной толщиной слоя d_e . Этот параметр соответствует толщине слоя, который обладает таким же поглощением при прохождении через него света.

Для повышения чувствительности часто используют каскад элементов отражения. Число отражений и толщины:

Чем длиннее и тоньше волновод, тем больше N и тем чаще нерас-простраи яющаяся волна взаимодействует со слоем комплекса анти-тело-аитигеи на поверхности. Если в случае однократного отражения коэффициент отражения равен:

где а - коэффициент поглощения, ad_e - эффективная толщина слабопоглощающего слоя, то после N отражений соответствующий коэффициент отражения R^N равен:

т.е. вызванное поглощением уменьшение интенсивности света возрастает в N раз.

Нераспростраияющуюся волну можно использовать для контроля реакций на поверхностях с помощью ряда оптических методов. В этом обзоре основное внимание уделено методу ПВОФ.

Полное внутреннее отражение с флуоресценцией

Если на поверхность отражения ЭВО нанести светопоглощающий материал, то интенсивность света, претерпевшего полное внутреннее отражение, будет меньше интенсивности падающего света и будет зависеть от длины волны. Его интенсивность будет зависеть от длины волны падающего света. В методе ПВОФ используются флуоресцирующие вещества и поглощенная энергия частично выделяется снова в виде флуоресценции, интенсивность которой и измеряют.

Регистрировать сигнал флуоресценции, возникающей на границе раздела волновод-раствор, можно различными способами: 1) обычным способом, помещая детектор перпендикулярно границе раздела, 2) располагая детектор на пути отраженного первичного луча.

Принимая во внимание, что при втором способе регистрации угол эмиссии света очень мал, этот способ может показаться не слишком эффективным. Однако в этом случае проявляется усиливающий эффект, а теория предсказывает, что если волновод изготовлен из плавленого кварца и второй средой с показателем преломления п₂ является водный раствор, то интенсивность флуоресценции может быть в 50 раз выше интенсивности флуоресценции, испускаемой перпендикулярно волноводу. Этот эффект, называемый обратным туннелированием флуоресценции, подтвержден как теоретически, так и экспериментально.

На первом этапе падающая плоская волна генерирует нераспространяющуюся волну, которая возбуждает молекулы, находящиеся вблизи поверхности, пропорционально интенсивности затухающего электрического поля. После определенного времени жизни в возбужденном состоянии эти молекулы флуоресцируют; локальное распределение интенсивности эмиссии флуоресценции очень близко распределению интенсивности возбуждения флуоресценции, описываемому уравнением, т.е. эмиссия флуоресценции - это также нераспространяющаяся волна, но с другим волновым числом. На вопрос, что происходит с нераспространяющейся волной флуоресценции, можно ответить, воспользовавшись принципом оптической обратимости. Этот принцип гласит, что свет возвращается в волновод в виде плоской волны так же, как и в первичном процессе, когда плоская волна генерирует нераспространяющуюся волну. Теоретически показано, что интенсивность эмиссии флуоресценции при критическом угле полного внутреннего отражения максимальна и-флуоресценция претерпевает внутреннее отражение.

Флуоресценция на границе раздела принципиально отличается от флуоресценции в растворе, где испускаемый свет изотропен. Флуоресценция на оптической границе раздела предпочтительно претерпевает обратное туннелирование в волновод под углом, близким к критическому. Такая флуоресценция называется анизотропной; ее необходимо учитывать при конструировании волноводов и соответствующих приборов.

Волноводы и приборы.Одним из ключевых элементов систем спектроскопии внутреннего отражения является волновод, геометрия которого зависит как от природы изучаемого образца, так и от используемого метода регистрации. Предложено большое число различных волноводов, простейшим из которых является призма отражения. Обычно применяют призму с фиксированным углом в; жидкости можно удерживать на отражающей поверхности призмы с помощью проточной кюветы. Необходимая в иммуноанализе высокая чувствительность достигается за счет элементов многократного внутреннего отражения, поскольку при увеличении числа отражений N усиливается интенсивность спектра. Величину N можно увеличить путем удлинения и утоньшения пластин. На практике длина и толщина с тем, чтобы оптимизировать различия между спектрами возбуждения и эмиссии. В описываемой системе угол в изменяли путем перемещения или вращения зеркала.

Очень перспективным элементом внутреннего многократного отражения является волоконная оптика. В волокно свет вводят под углом, большим в_е ; он распространяется вдоль волокна путем Полного внутреннего отражения. В настоящее время доступны световоды из волокна с высокими оптическими свойствами, предназначенные для промышленных средств связи. Такие световоды использовались в качестве ЭВО, так как в силу их небольшого диаметра и неограниченной длины эффективное число' отражений может быть очень большим. Для методов иммуноанализа с ПВОФ применяли ЭВО как в виде пластины, так и в виде цилиндрических нитей.

Как отмечалось выше, для измерения интенсивности флуоресценции на границе раздела могут быть применены два подхода.

В первом, более традиционном, подходе измеряют интенсивность флуоресценции, направленной перпендикулярно поверхности волновода. В этом случае ие возникает проблем при разработке конструкции прибора, но используется, по крайней мере теоретически, неэффективный способ измерения флуоресценции, возникающей на границе раздела. Во втором подходе с измерением флуоресценции на пути первичного луча возможны по меньшей мере два способа регистрации. Туииелироваииую флуоресценцию можно детектировать на входе или иа выходе волновода. Предложены конструкции приборов для измерения флуоресценции 1) под прямым углом к пластинчатым волноводам; 2) на выходе стекловолоконного или пластинчатого волновода; 3) на входе стекловолоконного волновода.

Целесообразно подробнее рассмотреть последнюю конструкцию, поскольку в ней могут быть применены как волоконные, так и пластинчатые ЭВО и она имеет ряд преимуществ перед другими конструкциями.

Во-первых, измерение флуоресценции на пути первичного светового луча обычно более эффективно, чем в перпендикулярном направлении. Во-вторых, измерение флуоресценции на выходе из волновода связано с необходимостью высокоэффективной оптической фильтрации света для отделения света возбуждения от света эмиссии. К тому же испускаемый свет составляет лишь малую долю света возбуждения; поэтому фильтры должны пропускать очень узкую полосу и обладать очень высокой эффективностью пропускания излучаемого света. По нашим данным, удовлетворительную фильтрацию обеспечивают несколько фильтров и последующих решетчатых моиохроматоров. Эту проблему можно было бы частично разрешить с помощью флуоресценции с временным разрешением или флуорофоров с большим стоксовым сдвигом, чем у флуоресцеина. Однако в настоящее время новые флуорофоры с достаточно продолжительным временем свечения еще малодоступны, а специфические свойства не позволяют применять их непосредственно в ПВОФ.

Малодоступны и флуорофоры с большим стоксовым сдвигом, например фикобилипротеины, как и соответствующие эффективные оптические фильтры. Измерение флуоресценции, генерированной в обратном направлении к лучу возбуждения, позволяет исключить эти проблемы, используя легкодоступные реагенты и оптические устройства. Типичная схема такого измерения флуоресценции представлена на рис. 6. В этой схеме свет возбуждения направляется в волновод через дихроичный делитель светового луча. Этот делитель отражает свет возбуждения и пропускает свет эмиссии. Здесь практически полностью подавляется фоновый сигнал света возбуждения, так как последний направляется от детектора.

ПРИМЕНЕНИЕ

Все опубликованные данные о применении ПВОФ в иммуно-анализе суммированы в табл. 2. В общем случае использовались три типа аналитических систем с мечеными реагентами или определяемыми веществами.

Таблица 2. Применение принципа полного внутреннего флуоресценцией в иммуноанализе			отражения с
Определяемое вещество	Метка	Волновод	Литература
Фенил мышьяковая кислота	Флуоресцеин	Кварцевая пластина
Морфин	То же
Динитрофенильные	Родамин	N И
группы
Иммуноглобулин G	Триптофан	N И
Иммуноглобулин G	Флуоресцеин	N N
Иммуноглобулин G	и	Кварцевое волокно
Альбумин	N	То же
Трансферрин	"
Дигоксин	N	* м
Иммуноглобулин G	й	Стеклянная пластина

В первых работах по применению ПВОФ в иммуноанализе использовались меченые реагенты. В этих работах антитела метили флуоресцеином, а гаптены иммобилизовали в виде конъюгата с альбумином на поверхности кварцевой пластины. Количество меченных флуоресцеинизотиоцианатом антител, связавшихся с иммобилизованными гаптенами, определяли с помощью нераспространяющейся волны по возбуждению флуоресценции на границе раздела. Добавление в раствор свободного гаптена уменьшало скорость связывания меченных ФИТЦ антител с иммобилизованным на поверхности гаптеном пропорционально концентрации свободного гаптена. Флуоресценцию измеряли под прямым углом к поверхности. Предел обнаружения составлял 0,2 мкмоль/л морфина.

Близкий подход в сочетании с корреляционной спектроскопией флуоресценции использовал Томпсон. В этом подходе динитрофенол иммобилизовали на альбуминовой подложке на поверхности кварцевой пластины и изучали реакцию моновалентных и бивалентных антител, меченных родамином, с динитрофенолом.

В наших лабораториях создана система иммуноанализа с применением избытка меченого реагента. В этой системе использована тщательно отработанная двухсайтовая методика иммунофлуоро-метрического анализа, согласно которой иммобилизованные антитела первоначально инкубируют с раствором антигена в течение 15 мин. После отмывки биологической жидкости буферным раствором в систему добавляют вторые специфические антитела, меченные ФИТЦ, и изучают ход реакции с антигеном, иммунологически иммобилизованным на границе раздела. В некоторых случаях несвязанные белки, меченные ФИТЦ, удаляют путем отмывки буферным раствором и измеряют флуоресценцию связанного комплекса. Волновод с нанесенными на него антителами можно использовать повторно после промывки поверхности разбавленной НС1, которая разрушает иммунные комплексы.

На рис. 7 представлены типичные временные характеристики выходного сигнала системы; здесь же схематично объяснены основные этапы анализа. Флуоресценцию измеряли как под прямым углом к поверхности, так и параллельно первичному световому лучу на выходе волновода, в качестве которого применяли и пластины, и волокна. С помощью этой системы были определены оптимальные состав буферного раствора и угол падения светового луча.