Реферат: Гены идентичности цветковых меристем

Еще несколько генетических локусов по крайней мере немного влияют на судьбу цветковой меристемы. Хотя мутанты по гену арабидопсиса APETALA2 (АР2) и имеют цветки без признаков генеративного соцветия, в двойных мутантах aplap2, а также Ify ар2 проявляется роль гена АР2 в формировании цветковой меристемы. Более того, при совмещении apl и ар2 в двойных мутантах наблюдается синергидный эффект; органы в мутантных цветках располагаются по спирали, что характерно для побегов, а количество цветков, развивающихся на одном цветоносе, еще увеличивается. Вероятно, АР2 может функционировать в процессе развития меристем при отсутствии активностей LFY или API.

Ген арабидопсиса UNUSUALFLORALORGANS (UFO), как и LFY - важный активатор генов идентичности органов цветка. Мутанты ufo имеют черты как мутантов по генам идентичности цветковых меристем, так и генов идентичности органов цветка. Первые несколько цветков у них заменяются вторичными соцветиями. Как вторичные соцветия, так и основное соцветие у них заканчиваются карпелоидными или сепаяоидными (чашелистикообразными) структурами. Цветки таких вторичных соцветий характеризуются различными типами гомеозисных изменений в первых трех мутовках органов. Наиболее сильно при этом изменяются органы второй и третьей мутовок, в которых лепестки и тычинки заменяются химерными органами, состоящими из тканей чашелистиков, тычинок, карпел, а также филаментозных элементов. В основании многих цветков формируются прицветники или филаментозные структуры. Кроме того, мутанты ufo характеризуются уменьшением количества органов второй и третьей мутовок. Мутовчатое расположение органов у них выражено менее четко, и иногда трудно сказать, к какой мутовке относится тот или иной орган. Кроме того, у мутантов ufo нередко формируются прицветники без образования побегов или цветков в их пазухах. Разнообразие фенотипа мутантов свидетельствует о множественности функций гена UFO в развитии генеративной и цветковой меристем. Гену UFO приписываются следующие функции:

· установление кругового, или мутовчатого, характера формирования органов цветка;

· участие в контроле детерминированности развития цветка;

· активация генов типа органов цветка APETALA3 и PISTILA-ТА (см. далее), необходимых для развития лепестков и тычинок;

· определение границ между мутовками органов внутри цветочного зачатка.

Мутации в гене LFY в основном эпистатируют над мутациями ufo, что свидетельствует о возможном участии обоих генов в одном пути передачи сигнала. Чтобы проверить, справедливо ли предположение о том, что ген UFO может являться медиатором между геном идентичности меристем LFY и геном типа органов цветка АРЗ, растения арабидопсиса были трансформированы конструкциями с химерным геном из кодирующей последовательности гена UFO, слитой с конститутивным промотором p35S ВМЦК. В цветках таких трансгенных растений инициация экспрессии гена АРЗ происходила преждевременно и в местах, где у дикого типа этот ген не экспрессируется.

Таким образом, ген UFO и в самом деле является регулятором гена АРЗ. В цветках растений p35S::UFOIfy не формируются нормальные лепестки и тычинки. Ген UFO, по-видимому, способен нормально функционировать только при наличии активности гена LFY. Более вероятно, что ген UFO является частично вырожденным корегулятором, действующим вместе с геном LFY, а не просто медиатором между генами идентичности меристем и генами типа органов цветка.

Мутанты ufo похожи на мутанты по гену львиного зева FIM-BRIATA (FIM). Вероятно, эти гены являются гомологами. Фенотип мутантных по гену FIM цветков зависит от силы мутантной аллели. Цветки fim имеют лепестки с полосами тканей чашелистиков больших или меньших размеров. Такие полосы чаще всего располагаются в срединной части нижних лепестков. Иногда в пазухах второй мутовки чашелистиков развиваются вторичные цветки. В цветках сильного мутанта fim 62 тычинки часто заменяются карпелами, сливающимися с карпелами четвертой мутовки. Крайнее выражение мутантного фенотипа fim62 - недетерминированные цветки, состоящие из чашелистиков. Мутанты по генам UFO и FIM формируют цветки, очень сильно варьирующие по фенотипу, что справедливо для всех аллелей обоих генов.

Мутации в локусе арабидопсиса TERMINALFLOWER1 (TFLI) приводят к фенотипу, противоположному таковому для мутаций по генам идентичности цветковой меристемы. Апикальная и латеральная меристемы соцветия у них заменяются цветковыми меристемами. Кроме того, как тоже упоминалось ранее, мутанты tfllцветут раньше растений дикого типа. В отличие от растений арабидопсиса дикого типа, имеющих недетерминированное соцветие с множеством цветков и вторичными и третичными соцветиями, мутанты tfllимеют детерминированное первичное соцветие всего лишь с несколькими цветками и не образуют вторичных соцветий. Соцветие заканчивается аномальным цветком, состоящим из двух-трех неполных цветков. Похоже, вторичные меристемы соцветия у мутантов tfllзаменяются меристемами цветка, а первичная генеративная меристема превращается в 2—3 смежные цветковые меристемы. Можно предположить, что ген TFL1 необходим для поддержания функциональности, или компетентности, цветковой меристемы, хотя, по-видимому, он активен и в вегетативной фазе развития. TFL1 также играет роль в негативной регуляции экспрессии генов LFY и API в апикальных и латеральных меристемах, хотя такая регуляция может осуществляться и опосредованно.

Гомологом гена TFL1 у львиного зева является ген CENTRO-RADIALIS (CEN). В норме соцветия львиного зева, как и арабидопсиса, являются недетерминированными: цветки образуются в латеральных положениях, и никогда не формируется терминальный, или апикальный, цветок, который был бы последним цветком в соцветии. При этом гены FLO, LFY, SQUA и API экспрессируются в латеральных меристемах, но не в апикальной части соцветия. Однако в апексах меристемы мутантов сеп, как и tfll, образуются терминальные цветки. Как и ожидалось, вышеперечисленные гены экспрессируются в апексах меристем этих мутантов. Более того, условия окружающей среды, которые усиливают фенотип Ify, например короткий день, ослабляют фенотип tfll. Таким образом, гены CEN и TFL1, по-видимому, являются антагонистами генов, индуцирующих развитие цветка, и, возможно, могут предотвращать их экспрессию в апексе соцветия. На основе анализа фенотипов двойных мутантов предполагают, что TFL1 является антагонистом генов LFY, API и АР2. Мутации Ifyчастично супрессируют tfll, двойные мутанты Ifyaplили Ifyap2 характеризуются более выраженным супрессирующим эффектом на фенотип tfll. Терминальный цветок мутантов сеп обладает радиальной симметрией: все его лепестки напоминают вентральные лепестки цветков дикого типа. Количество органов цветка сеп и их филотаксис (расположение} очень вариабельны

Глава 2. Молекулярная характеристика генов, контролирующих идентичность цветковой меристемы

2.1 Молекулярная характеристика генов FLO (львиный зев) и LFI (арабидопсис)

Ген львиного зева FLO был клонирован одним из первых генов, влияющих на развитие цветка. Для его клонирования использовали мутант По-613, образующий генеративные соцветия вместо цветков. Однако гомозиготы по flo-613 изредка формировали нормальные цветки. Из семян этих цветков развивались растения дикого типа. Значит, мутация flo-613 генетически нестабильна и иногда ревертировала к аллели дикого типа. Реверсия коррелировала с эксцизией транспозона ТатЗ и, следовательно, мутантный фенотип был обусловлен инсерцией этого мобильного элемента в ген FLO. Таким образом, ген FLO был клонирован с использованием последовательности транспозона ТатЗ в качестве пробы. У всех ревертантов к дикому типу при использовании клонированного фрагмента гена FLO как пробы для гибридизации появлялся фрагмент длиной 4т. п. о. Такой же длиной обладал гибридизовавшийся с FLO фрагмент исходного растения дикого типа, использованного для транспозонового мутагенеза. При этом у некоторых ревертантов сохранялся фрагмент длиной 7.5 т. п. о., такой же, как и у мутанта flo-613. Вероятно, среди ревертантов были как гетерозиготные, так и гомозиготные растения.

Однако при гибридизации ДНК мутантных растений среди них тоже были выявлены гетерозиготы, у которых присутствовали оба фрагмента. Так, при секвенировании сайта эксцизии ТатЗ из гетерозиготы с фенотипом По обнаружили инсерцию 8 пар оснований. Таким образом, неточная эксцизия ТатЗ приводила к изменению рамки считывания, и мутантный фенотип сохранялся.

В сайте эксцизии у ревертанта отмечены замены двух пар оснований, и не обнаружены инсерции или делеции нуклеотидов. В потомстве от самоопыления всех гетерозиготных ревертантов имеются растения дикого типа и мутанты в соотношении 3:3. Потомство большинства гомозиготных ревертантов состояло только из растений дикого типа.

Мутация flo-613, как и многие другие гомеозисные мутации львиного зева, использованные для клонирования генов развития цветка и о которых пойдет речь в этой главе, была получена в массивном эксперименте по транспозоновому мутагенезу. Растения львиного зева с высокоактивными мобильными элементами Тат (от TransposoneofAntirrhinummajus) выращивали при температуре 15 °С. Именно при этой температуре для мобильных элементов группы Тат наблюдается наибольшая частота транспозиций. Многие из 26000 потомков Ml этих растений, полученных при самоопылении, содержали рецессивные мутации в гетерозиготном состоянии. Такие рецессивные мутации можно было выявить в следующем поколении М2 после самоопыления растений Ml. И в самом деле, среди 80000 растений М2 было обнаружено более 15 независимых гомеозисных мутаций, затрагивающих развитие цветка (рис.2).

Ген арабидопсиса LFY был клонирован по гомологии с геном львиного зева FLO. В отличие от многих других гомеозисных генов, затрагивающих развитие цветка, FLO и LFY, похоже, уникальные гены и не являются членами генного семейства. Кодируемые ими белки были на 70 % гомологичны друг другу и не обладали значительной гомологией ни с одним из известных на момент их клонирования белков. Наличие богатого пролином домена на N-конце и кислой области в центральной части белка свидетельствуют о том, что, вероятно, они могут служить активаторами транскрипции. Подтверждается это и тем, что белок Lfy локализован в основном в ядре. Характер их экспрессии очень похож. РНК FLO и LFY начинает накапливаться в закладывающихся зачатках цветка на границе цветочной меристемы и не обнаруживается в генеративной меристеме. В момент приобретения цветочными меристемами морфологических различий (стадии 1 и 2) экспрессия усиливается в равной степени по всему молодому зачатку цветка. На стадиях 3 и 4, когда индуцируется экспрессия генов идентичности органов, РНК FLO и LFY уже практически не обнаруживается в центре начинающего формироваться цветка. Из известных генов они первыми начинают экспрессироваться в клетках, из которых затем сформируется цветок.

Рис.2. Схематическое изображение генеративного побега арабидопсиса и начальные этапы экспрессии генов, регулирующие развитие цветка.

Однако в характере экспрессии FLO и LFY есть одно важное отличие, помогающее понять, как развиваются меристемы. Различие является следствием того, что у цветка львиного зева есть прицветники, а у цветка арабидопсиса их нет. Ген FLO экспрессиру-ется как в примордиях прицветников, так и в цветковых меристемах. В то же время для гена LFY не наблюдается экспрессия в клетках, окружающих цветковые меристемы, и, вероятно, соответствующих клеткам львиного зева, из которых образуются прицветники. У мутантов Ify на месте цветков дикого типа без прицветников образуются генеративные побеги или «цветки» с околоплодными листьями, которые можно отождествлять с прицветниками. Значит, продукт LFY дикого типа подавляет инициацию или образование прицветников. Предполагают, что ген LFY влияет на судьбу группы клеток на периферии цветочной меристемы: в цветках дикого типа все или большинство этих клеток формируют цветочную меристему, тогда как у мутантов Ify эти клетки дают начало меристеме и примордию прицветника. В этом отношении мутант Ifyпохож на дикий тип растений таких видов, как Antirrhinummajus, у которых из одного зачатка образуются меристема цветка и прицветник. Считается, что наличие прицветников - эволюционно более древний признак.

Насколько универсальны охарактеризованные механизмы индукции цветка? Пока что на этот вопрос ответить не просто. Похоже, что для табака, который является более близким родственником львиного зева, чем арабидопсис, индукция развития цветковой меристемы происходит по-другому. Гены табака NicotianatabacumNFL1 и NFL2, гомологи генов FLO и LFY, транскрибируются во время как вегетативного, так и репродуктивного развития растений. Их экспрессия не инициируется во время индукции цветка, как это характерно для генов FLO и LFY. Возможно, это связано с тем, что табак имеет терминальный цветок, в то время как соцветия львиного зева и арабидопсиса не детерминированы. Трансгенные растения арабидопсиса, в которых конститутивно экспрессируется ген LFY, тоже имеют терминальный цветок. В геномах диплоидных растений львиного зева и арабидопсиса имеется только одна копия гена FLO или LFY. Табак же является аллотет-раплоидом, и каждый из его диплоидных геномов содержит по одной копии гомологичного FLO/LFY гена.

2.2 Молекулярная характеристика генов SQUA (львиный зев) и AP 1 (арабидопсис)

Ген львиного зева SQUA был клонирован с использованием в качестве пробы гена DEF из этого же растения, содержащего MADS-бокс (MADS-бокс — это последовательность ДНК, кодирующая домен MADS. Он получил свое название от четырех клонированных первыми генов с этим боксом: МСМ1, AGAMOUS, DEFICIENS, SRF. Домен MADS представляет собой консервативную область белков - факторов транскрипции, участвующую в связывании с ДНК (подробнее об этом см. далее). По гомологии с DEF было выделено 9 независимых генов львиного зева. Один из клонов при гибридизации геномных блотов по Саузерну проявлял рестрикционный полиморфизм для ДНК дикого типа и нестабильной мутации squa-29. Ревертанты SQUA имели фрагмент ДНК такой же длины, как и растения дикого типа.

Ген арабидопсиса API был клонирован как новый член семейства генов, содержащих MADS-бокс.

Белки Squa и Apl характеризуются 68%-ной гомологией. Наличие в этих белках домена MADS предполагает, что они могут специфически связываться с ДНК и функционировать как активаторы транскрипции. РНК SQUA и API индуцируется в молодых цветочных примордиях, как только они становятся видимыми на границе генеративной меристемы (чуть позже, чем РНК FLO и LFY). На стадиях I и 2 РНК SQUA и API однородно экспрессируется по всему примордию цветка (рис. 11.33), на стадии 3 экспрессия снижается в двух внутренних мутовках, и затем РНК API обнаруживается только в примордиях чашелистиков и лепестков. РНК SQUA, кроме того, менее интенсивно экспрессируется и в примордиях прицветников и карпел. В вегетативных органах, за исключением самых верхних листьев, примыкающих к соцветию, РНК SQUA не обнаруживается (рис. 11.32, в).

Ген SQUA экспрессируется в мутантах flo, а ген FLO — в мутантах squa. Таким образом, FLO и SQUA активируются независимо друг от друга. Подобным образом, ген LFY экспрессируется в мутантах apl. Фенотип двойных мутантов flosquaи Ifyaplвыражен значительно сильнее, чем фенотип одиночных мутантов по этим генам, что также свидетельствует о независимом и синергид-ном действии этих генов в процессе формирования цветковой меристемы и о частичной вырожденности их активностей.

Ген LFY не только необходим для формирования цветка, но и достаточен для определения идентичности цветка, т.е. развития меристемы как цветковой меристемы. Основной побег трансгенных растений p35S::LFY с конститутивной экспрессией этого гена переходит к цветению раньше, чем растения дикого типа, а вторичные побеги превращаются в цветки. Хотя ген API экспрессируется несколько позднее, чем LFY, он тоже необходим для инициации развития цветка. Конститутивная экспрессия трансгена p35S::APl тоже ускоряет переход растения к цветению и приводит к образованию цветков на месте вторичных побегов. По-видимому, гены LFY/AP1 и FLO/SQUA оказывают наибольшее влияние на инициацию цветковых меристем. Однако в этот процесс вносят определенный вклад и другие гены.

2.3 Молекулярная характеристика гена CAL (арабидопсис)

Ген арабидопсиса CAULIFLOWER очень похож на ген API, что и было использовано для его клонирования. Как и API, ген CAL тоже кодирует белок с доменом MADS, и, следовательно, тоже может являться активатором транскрипции. Последовательности белков Cal и Apl имеют гомологию 70 %. Внутри домена MADS они различаются только пятью аминокислотными остатками из 56, т. е. оба белка, вероятно, узнают похожие последовательности ДНК и участвуют в регуляции сходных генов. Таким образом, функциональная вырожденность этих генов, обнаруживаемая в генетических исследованиях, подтверждается их структурным сходством. Однако, хотя данные молекулярного анализа хорошо согласуются с фактом функциональной вырожденности генов CAL и API, они не дают ответа на вопрос, почему CAL может только частично заменять API.

Ген CAL начинает экспрессироваться в примордиях цветков одновременно с геном API, и затем тоже обнаруживается только в примордиях двух наружных мутовок органов. В отличие от API, РНК которого накапливается в больших количествах в процессе развития лепестков и чашелистиков, РНК CAL в примордиях этих органов обнаруживается лишь в небольших количествах. Возможно, именно поэтому CAL неспособен заменить API при формировании лепестков и чашелистиков. Какова же роль гена CAL в развитии цветка? Данные молекулярного анализа свидетельствуют о том, что в двойных мутантах aplcalконцентрация РНК LFY очень сильно редуцирована, в то время как в мутантах aplона не отличается от таковой для дикого типа. Таким образом, функция CAL может заключаться в поддержании активности гена LFY. Вероятно, поэтому и фенотип тройных мутантов Ну aplcalне отличается от фенотипа двойных мутантов Ifyapl: если ген LFY инактивирован, ген CAL уже неспособен влиять на его активность.

Соцветия цветной капусты Brassicaoleraceavar. botrytis и капусты-брокколи Brassicaoleraceavar. italica представляют собой одну из аномалий развития цветка. Как и многие другие разновидности используемой для еды капусты - такие, как капуста белокочанная и краснокочанная, брюссельская, листовая, - обе эти разновидности тоже произошли от Brassicaoleracea дикого типа. Как известно, Brassica и арабидопсис относятся к одному семейству - крестоцветных, и их соцветия дикого типа и фенотипа cauliflowerморфологически очень похожи. При исследовании двух достаточно отдаленных видов растений, арабидопсиса и львиного зева оказалось, что механизмы, контролирующие развитие цветка, у них довольно консервативны. Гомологи почти всех клонированных генов есть у обоих видов, и типы их экспрессии очень похожи. Следовательно, не должно быть сюрпризом то, что молекулярная основа фенотипа cauliflowerу арабидопсиса и близкородственной Brassicaoleraceavar. botrytis могут быть идентичны. Чтобы проверить, так ли это на самом деле, были клонированы гомологи гена CAL - bobCAL из цветной капусты, boiCAL из брокколи и boCAL из Brassicaoleracea дикого типа. Как оказалось, открытая рамка считывания гена bobCAL прерывается стоп-кодоном в пятом экзоне, и соответствующий мутантный белок имеет молекулярный вес 17 кДа вместо белка дикого типа с молекулярным весом 30 кДа. В гене boiCAL не обнаружили подобный стоп-кодон, однако, в нем имеется делеция кодонов пяти аминокислотных остатков, а также аминокислотные замены в двух из трех кодонах, которые изменены у мутанта арабидопсиса cal-1. Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу того, что фенотипы соцветий цветной капусты и брокколи по крайней мере частично обусловлены мутациями в гене CAL.

2.4 Молекулярная характеристика гена FIM (львиный зев)

Ген львиного зева FIM был клонирован с использованием метода транспозоновой мишени. Мутанты fun619 и fim 620 с инсерцией мобильных элементов были получены в описанном выше эксперименте по мутагенезу. Ген арабидопсиса UFO был клонирован по гомологии с геном FIM: фрагмент гена FIM почти полной длины использовали как пробу для гибридизациии с геномной библиотекой арабидопсиса. Нуклеотидные последовательности генов FIM и UFO обладают значительной степенью гомологии. В то же время последовательности этих генов не обнаруживают значительного сходства с какими-либо другими нуклеотидными последовательностями, имеющимися в базах данных. Оба гена, FIM и UFO, активируются в молодых цветковых меристемах раньше генов типа органов цветка. Инициация их экспрессии наблюдаетсяв центре цветковой меристемы, и затем эта область «расходится» в стороны и превращается в кольцо, в центре которого РНК FIM или UFO уже не обнаруживаются. Еще позднее экспрессия этих генов ограничивается небольшой областью между мутовками лепестков и других органов. UFO работает только в области между чашелистиками и лепестками, в то время как ген FIM экспресси-руется как между мутовками чашелистиков и лепестков, так и между мутовками лепестков и тычинок.