Реферат: Иммуноанализ методом подсчета частиц
IgA
IgM
Подклассы IgG й IgA Тироксинсвязывающий глобулин Тироглобулин Тиротропный гормон Плацентарный лактогеи человека /J-Субъединица хориогоиадотропина человека /J-Микроглобулин Ретинолсвязьшающия белок Кансулярный антиген Н.influenzaeКапсулярные антигены StreptococcuspneumoniaeАнтигены StreptococcushaemofyueusМоновалентные антигены:
Тироксин
Тринодтиронин
Дигоксин
Антитела: Ревматоидный фактор Блокирующие антитела против яда пчел Антитела против BrucellaabortusСпецифические антитела IgE Антитела против основного белка миелина Антитела против тироглобулина Антитела против столбняка Антитела против простого иируса герпеса типа 1
Иммунные комплексы:
Обнаружение с ревматоидным фактором
Обнаружение с мышиными Clq-ков, гаптенов, антител и иммунных комплексов, определяемых этим методом. В настоящее время тринадцать наборов реагентов для выполнения таких анализов производятся в промышленном маштабе и поступают в продажу.
4. НОВЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
В этом разделе будут рассмотрены не публиковавшиеся ранее результаты двух исследований, иллюстрирующие возможности и эффективность метода. Детали этих исследований будут вскоре опубликованы. В первом исследовании для изучения развития инфекции Brucellaarbortusподопытных животных заражали этими организмами и забивали партиями по четыре мыши через определенные промежутки времени. Как показано на рис. 6, основным критерием развития инфекции может служить число образующихся колоний. Параллельно по степени ин-гибирующей активности определяли липополисахаридные антигены, а также циркулирующие иммунные комплексы и суммарное количество антител. Нетрудно видеть, что между CFU и количеством LPS-антигенов существует хорошая корреляция. Увеличение во времени концентрации антител и циркулирующих иммунных комплексов определяет иммунный статус. Эти исследования в настоящее время переносятся на крупный рогатый скот и на человека с тем, чтобы результаты можно было использовать в диагностике и при лечении.
Во втором исследовании показана возможность применения метода для измерения очень низких концентраций белков. В тиро-идной эндокринологии постоянно ощущается потребность в высокочувствительных методиках определения тироидстимулирующего гормона. Такие методики позволяли бы надежно отличать больных тиротоксикозом, а также микседемой от здоровых людей. Более того, при острых эутотироидных синдромах такие методики менее проблематичны, чем определение свободного тироксина, поскольку на их результаты не влияют посторонние вещества, часто присутствующие в сыворотке больных, страдающих этими заболеваниями.
На рис. 8 представлена схема первого гомогенного высокочувствительного метода определения TSH; благодаря одночасовой инкубации это самый быстрый из описанных до настоящего времени методов определения TSH в сыворотке человека. В нем используются два типа моноклональных антител на различных латексах. Предел обнаружения и калибровочная кривая представлены на рис. 9.
Предварительные результаты исследования сыворотки группы здоровых людей и группы больных тиротоксикозом представлены на рис. 10. Результаты анализа позволяют четко различить эти две группы. В гипертироидной группе оказался один пациент с Т3 -токсикозом, у которого концентрация TSH превысила предел обнаружения. Тироидный статус этого пациента точно неизвестен.
Аналогичные результаты определения TSH позднее были получены методом радиоиммуноанализа с набором реагентов BehringHS-TSH. Вероятно, этот пациент ошибочно был включен в группу больных тиротоксикозом.
5. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА
Из приведенных выше данных видно, что определение TSH в сыворотке человека с помощью метода IMPACT позволяет в 10 -1000 раз повысить чувствительность по сравнению с турбидимет-рическим иммуноанализом с латексной агглютинацией. По чувствительности описанный метод сравним с иммунорадиометрическим анализом и превосходит флуоресцентный, хемилюминес-центный или ферментный иммунометрические методы анализа.
Как показано на рис. 11, в методе IMPACT -используется избыток антител. Однако по своим характеристикам метод IMPACT располагается скорее между собственно иммунометриче-скими методами и конкурентным иммуноанализом, причем связывание антигена с антителом, возможно, усиливается за счет множества слабых взаимодействий.
Физические основы метода сложны и пока еще не до конца изучены. Чувствительность анализа определяется: 1) числом частиц, 2) поверхностной плотностью антител или антигена, 3) константой связывания антител, 4) возможно, псевдоконстантой связывания антител, 5) погрешностью Пуассона при подсчете частиц в потоке, проходящем через ячейку.
Чувствительность метода можно увеличить примерно в 100 раз, если подсчитывать агглютинированные частицы. При этом должна также устраняться компонента погрешности Пуассона, обусловленная фоном неагглютинированных частиц. Подсчет агглютинированных частиц довольно сложен. Относительное содержание определяемых димеров, тримеров, тетрамеров и высших олиго-меров зависит от природы изучаемого вещества и от его концентрации. Прототип детектора с высокой разрешающей способностью разработан фирмой AcadeDiagnosticSystems и предназначен для определения альфа-фетопротеина методом IMPACT. Для решения проблемы сложного характера агглютинации детектор, функционируя в кинетическом режиме, определял только димер. Таким путем всего за 4 мин удалось с высокой чувствительностью определить концентрацию димера прежде, чем успели образоваться заметные количества высших олигомеров.
6. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ
Система IMPACT находится в такой стадии развития, когда уже создана прочная основа для дальнейшего совершенствования путем расширения круга определяемых веществ и разнообразия методик. В этом контексте вырисовываются три основных пути развития системы: 1) определение новых веществ, 2) совершенствование химических процессов, 3) совершенствование приборов.