Реферат: Иммунологические методы

ВВЕДЕНИЕ

В иммунологии применяется целый ряд экспериментальных методов из других областей биологии. Так, выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярно-генетическими методами. Вместе с тем в иммунологии разработаны и свои специальные методы исследования, основанные на взаимодействии антиген—антитело. Эти иммунологические методы в свою очередь нашли применение в различных областях биологии. В частности, любые молекулы, обладающие антигенными свойствами, можно выявлять в тканях иммуногистохимическими методами. Для количественного определения таких молекул, присутствующих в чрезвычайно низких концентрациях, применяют радиоиммуноанализ и ферментный иммуносорбентный анализ. В настоящее время существуют сотни разнообразных иммунологических методов: наиболее широко применяемые из них описаны в этой работе.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО

Реакция преципитации. Одним из первых описанных проявлений взаимодействия антиген—антитело было образование преципитата при смешивании обоих реагентов в эквивалентных или близких к эквивалентным количествах. Оно наблюдается при постановке классической реакции преципитации с растворимыми антигенами и антителами. Если проводить эту реакцию в агаровом геле, можно дифференцировать отдельные реакции антиген—антитело, обусловленные различными популяциями антител, присутствующими в сыворотке. Такой метод, названный методом двойной иммунодиффузии, применяется также для проверки сходства между различными антигенами.

Однако некоторые смеси антигенов слишком сложны для разделения просто путем диффузии и преципитации, и для анализа таких смесей был разработан метод иммуноэлектрофореза — прежде чем выявлять антигены визуально в реакции преципитации, их разделяют по заряду с помощью этого метода.

Методы, основанные на диффузии в геле, позволяют определять антигены и антитела лишь качественно, количественную же оценку реагирующих компонентов проводят разработанным позднее методом простой радиальной иммунодиффузии.

Иммунодиффузию в электрическом поле можно производить с одновременным встречным движением антигенов и антител; этот способ назван встречным электрофорезом. Аналогичная модификация простой радиальной иммунодиффузии получила название ракетный электрофорез.

Описанные методы используются для определения антигенов и антител в концентрации от 20 м кг/мл до 2 мг/мл.

Реакции гемагглютинации и связывания комплемента

Если антитела присутствуют в столь низких концентрациях, что их не удается обнаружить и количественно определить при помощи встречного и ракетного электрофореза, применяют реакцию гемагглютинации. Она основана на способности антител перекрестно связываться с эритроцитами, взаимодействуя с их поверхностными антигенами.

Реакция антиген—антитело ведет к образованию иммунных комплексов, которые связывают комплемент при его активации по классическому пути, и на этом основан один из количественных методов определения антигенов и антител. С помощью реакций гемагглютинации и связывания комплемента удается выявлять антитела, присутствующие в концентрации <1 мкг/мл.

Прямая и непрямая иммунофлуоресценция

Иммунофлуоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам. Хотя эти методы технически более сложны, чем описанные выше, они имеют явное преимущество в тех случаях, когда требуется определить число видов антител. Используя срезы тканей, на одном предметном стекле можно выявить антитела к нескольким разным антигенам, установив при этом их внутритканевое или внутриклеточное распределение.

Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентных тестов можно идентифицировать отдельные клетки в клеточной суспензии, т. е. выявлять антигены на поверхности живых клеток. Для этой цели суспензию живых клеток, флуоресцентно окрашенных специфичными реагентами, пропускают через проточный флуоресцентный клеточный сортер — прибор, измеряющий интенсивность свечения каждой клетки в разных областях спектра и затем разделяющий клетки по параметрам свечения. Данный метод позволяет выделять различные клеточные популяции, т. е. разделять клетки, несущие специфические поверхностные антигены и соответственно этому окрашенные различными флуоресцентно меченными антителами.

Иммунологический анализ антигенов и антител с помощью меченых реагентов

Методы этой категории отличаются очень высокой чувствительностью и экономичностью в расходовании реагентов. Наиболее распространенный из всех иммунологических методов — это, вероятно, иммуносорбентный анализ антител с применением лигандов, меченных радиоизотопами или ферментами; он позволяет исследовать большое число образцов в относительно короткое время. Количество антигена можно измерять при помощи метода «двойной антигенной ловушки» или конкурентного иммуноанали-за с применением любого маркера для определения.

Иммуноблоттинг и иммунопреципитация

Описанные выше методы обычно применяют для определения уровня конкретных известных антигенов и антител, однако часто необходимо идентифицировать и охарактеризовать не известные заранее антигены, содержащиеся в многокомпонентной смеси. Для этой цели особенно подходит иммуноблоттинг.

При проведении иммуноблоттинга сложную смесь антигенов вначале подвергают гель-электрофорезу, а затем фракционированные пептиды переносят на лист нитроцеллюлозы для идентификации индивидуальных антигенов при помощи специфических антисывороток. Производя предварительное разделение в геле с додецилсульфатом натрия или в геле для изо-электрического фокусирования можно получить данные о размерах и изоэлектрической точке исследуемых антигенов, а также о сходстве между ними.

В некоторых случаях в результате электрофореза в геле и процедуры блоттинга антиген денатурирует так, что некоторые из его эпитопов разрушаются и теряют способность связываться со специфическими антителами. В такой ситуации вместо блоттинга следует использовать иммунопреципитацию, чтобы установить, какой антиген связывают антитела. Данный метод может быть применен для определения как растворимых, так и мембранных антигенов.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ АНТИТЕЛ

В иммунологических исследованиях часто возникает необходимость в получении очищенных препаратов антител, т. е. антигенспецифичных либо неспецифичных иммуноглобулинов. Выделение неспецифичных иммуноглобулинов из сыворотки обычно проводят путем последовательного фракционирования белков, которое включает следующие этапы.

• Осаждение гамма-глобулинов в 30—50% растворе сульфата аммония.

• Гель-фильтрация для получения молекул соответствующих размеров.

• Ионообменная хроматография с целью выделения молекул, несущих суммарный положительный заряд при нейтральном рН.

• Аффинная хроматография с использованием естественных лигандов иммуноглобулинов, например стафилококкового белка А.

Выделение антигенспецифичных иммуноглобулинов осуществляют методом аффинной хроматографии. Антиген «пришивают» к частицам сефарозы и связавшиеся с ним «чистые» антитела элюируют с иммуносорбента хаотропными агентами или буферным раствором. Метод аффинной хроматографии применяют и для получения очищенных препаратов антигенов.

Получение моноклональных антител

Другим способом получения индивидуальных антител определенной специфичности служит гибридомная технология — создание иммортали-зованной линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности, т. е. моноклональные. В такой культуре можно поддерживать антителообразование неопределенно долгое время. Моноклональные антитела несравнимо лучше соответствуют целям иммуноанализа, чем гетерогенные сыворотки, получаемые от иммунных животных, и поэтому нашли широкое применение в различных областях биологии в качестве высокоспецифичных зондов.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--