Реферат: Исследование апоптотической активности лимфоцитов периферической крови in vitro при инфекционном мононуклеозе и мононуклеозоподобном синдроме

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Инфекционный мононуклеоз.

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) представляет собой острое, обычно доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, чаще всего встречающееся в детском юношеском возрасте (реже у взрослых), сопровождающееся иногда серьезными осложнениями, а в редких случаях даже приводящее к летальному исходу [Живица Л.В. и соавт.,1987; Дунаевский О.А., Постовит В.А.,1982]. Заболевание вызывается EBV, что впервые было показано Henle и соавторами [Купчинский Р.А.,1994].

Вирус EBV представляет собой В-лимфотропный вирус человека, относится к семейству Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesviridae, рода Lymphocryptovirus [Львов Н.Д., Мельниченко А.В.,1999]. Для него характерна сферическая форма и наличие 4 структурных компонентов: сердцевина, капсида, внутренние оболочки, внешние оболочки. Сердцевина содержит линейную двунитчатую вирусную ДНК, которая состоит из 80 генов. Размер вириона у основного возбудителя ИМ колеблется от 100 до 150 нм [Бисярина В.П. и соавт.,1980; Shuster W. e.a.,1993]. В составе вирионов обнаружено более 30 гликопротеидов, которые находятся на поверхности и вызывают образование вируснейтрализующих антител [Albeck H. e.a.,1985]. Вирус чувствителен к воздействию эфира, весьма специфичен в отношении роста: размножается в культурах лимфобластов опухоли Беркитта, крови больных ИМ, лейкемических клетках и в культуре клеток мозга здорового человека. [Дранкин Д.И., 1982;]. Устойчивость EBV во внешней среде низкая. Он быстро погибает при высыхании, высокой температуре, обработке всеми дезинфицирующими средствами [Imai S.,1990].

EBV отличается от других вирусов семейства герпеса способностью вызывать не цитолиз, а размножение пораженных клеток – В-лимфоцитов. Вирус способен к длительной персистенции в них [Khanna R. e.a.,1995].

Проникновение EBV в клетку хозяина является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя прикрепление вирионов к клеточным рецепторам, эндоцитоз и слияние мембран вирионов и клетки. В результате этого капсид освобождается от белков внешней оболочки, а комплекс ДНК-белок вируса проникает в ядро [Wutzler P.,1993]. Вирионная ДНК выходит в нуклеоплазму и транскрибируется клеточной РНК-полимеразой, затем проходит процессинг мРНК, синтез кодируемых продуктов и частичный обратный транспорт их в ядро, репликация ДНК и формирование дочерних молекул [Wilson A.D. e.a.,1998]. Образовавшиеся в ядрах клеток незрелые капсиды попадают в цитоплазму, где заканчивается формирование зрелых капсидов и внешней оболочки вируса с последующим транспортом к поверхности и выходом их из клетки [Nikolas J.C. e.a.,1998; Straus S.E. e.a.,1993].

При проникновении в организм человека первоначально EBV поражает эпителиальные клетки носо- и ротоглотки, а затем инфицирует В-лимфоциты, участвующие в диссеминации возбудителя по организму [Дранкин Д.И., Заяц Н.А., 1982].

Эпителиальные клетки могут быть инфицированы EBV через EBV-специфичный С2- рецептор. При этом процессы деления, дифференцировки и созревания клеток эпителиального слоя протекают параллельно с процессом активного вирусного воспроизводства [Taga H. e.a.,1995; Wakasugi N. e.a.,1990]. Таким образом, как считают авторы, "эпителиальная EBV-инфекция" - играет решающую роль в воспроизводстве и пожизненной персистенции вируса в организме человека [Foss H.D.1995; Ritter S., Schroder S.,1996].

По современным данным, EBV является возбудителем ИМ в 90% случаев заболевания. К гипердиагностике ИМ у детей могут привести острые инфекционные заболевания с мононуклеозоподобным синдромом (ОИЗ с МПС). Так МПС может наблюдаться при цитомегалии, иерсинеозе, токсоплазмозе и различных формах ангин (фоликулярная, лакунарная, некротическая).

Считается, что во всех случаях EBV играет свою роль совместно с другими факторами, вызывающими иммуносупрессию. В этой связи, заслуживают внимание работы, касающиеся связи EBV и ВИЧ. EBV выявляется в ротовой полости у ВИЧ-инфицированных больных [Жданов В.М.,1984; Anderson J. e.a.,1986]. Механизм взаимодействия EBV с ВИЧ не установлен, хотя известно, что оба вируса поражают одни и те же рецепторы лимфоидных клеток. Высказывается предположение о том, что EBV может блокировать проникновение ВИЧ в клетку [Зуев В.А.,1988]. С другой стороны, имеются сообщения о том, что продукты деятельности EBV активируют экспрессию вируса СПИД [Йегер Л.,1990].

Определяющими проявлениями заболевания являются: клиническая картина (высокая температура, ангина, увеличение лимфоузлов, печени, селезенки), характерные гематологические изменения (увеличение общего количества мононуклеарных клеток и атипичных лимфоцитов) и положительная реакция на гетерофильные антитела [Bevinck J.N.B. e.a.,1993; Cozad J.,1996; Moss D.J. e.a.,1992]. Следует, однако, отметить, что ни один из указанных признаков не является специфичным для ИМ [Титов и соавт.,1999; Kube D. e.a.,1995]. Диагноз заболевания ставится по совокупности клиники и лабораторных данных. [Гаспарян М. О. 1972; Жибурт и соавт.,1996; Titov L.P. e.a.,1995,1996].

Инкубационный период длится от 2 до 30 дней, чаще 4-7 дней. Заболевание обычно начинается остро, с озноба и повышения температуры до 38-39 С. У некоторых больных в течение 2-3 дней отмечаются продромальные явления в виде слабости, недомогания, потери аппетита [Di Giuseppe J.A. e.a.,1995; Matter L. e.a.,1987]. Заболевание может давать рецидивы. Больные обычно бледны, конъюнктивы умеренно гиперемированы [Мусабаева И.К.,1982; Леенман Е.Е. и соавт.,1999; Verdium C.M. e.a.,1995]. На 2-3 день болезни иногда возникает скарлатиноподобная, узелковая или папулезная сыпь, а у детей при тяжелом течении заболевания геморрагическая сыпь. Исчезновение сыпи может сопровождаться отрубевидным шелушением [Уразова Л.Н. и соавт.,1989; Schuster V. e.a.,1992]. Постоянным симптомом первых дней болезни является увеличение передне- и заднешейных лимфоузлов, одновременно увеличиваются и другие группы лимфоузлов: подмышечные, паховые. Лимфоузлы плотноватые, болезненные, никогда не спаиваются с окружающей клетчаткой и кожей, не наблюдается их нагноения [Серебряная и соавт.,1998; Hinderer W. e.a.,1990]. Может наблюдаться изолированное увеличение внутригрудных лимфоузлов, что вызывает серьезные дифференциально-диагностические затруднения. Реакция лимфоузлов брюшной полости может проявляться болями в животе, особенно в правой подвздошной области (симптом Корсакова) [Wising P.J.,1939,1942]. Процесс обратного развития в лимфоузлах начинается с нормализации температуры, но обычных размеров они достигают в течение 1-2 недель периода реконвалесценции, а иногда и через несколько месяцев [Чирешкина Н.М.,1973; Naher H. Petzoldt D.,1992].

Заболевание обычно сопровождается ангиной, которая по своему характеру бывает лакунарной, катаральной, фолликулярной и язвенно-дифтеритической. В первые дни болезни ангина, как правило, односторонняя и носит характер катаральной, а с 3-4 дня отмечается ангина, которая рассматривается как результат аллергизации организма [Murtagh J.,1990; Toren A.,1996; Wolf Y. e.a.,1993]. Если в этот период присоединяется вторичная инфекция, у больного повышается температура и ухудшится самочувствие. Изменения в зеве исчезают через 1-2 недели после начала заболевания [Grasi G. e.a.,1993]. Иногда ангина отсутствует, часто она сопровождается резкой гиперемией слизистой оболочки зева и носоглотки (“пылающий зев”) [Mayer I. e.a.,1992; Wurtzler P.,1993].

К важным симптомам относятся увеличение печени и селезенки. Печень плотная, в ряде случаев нарушается ее функция, появляется желтуха. Селезенка плотная, чувствительна при пальпации, иногда достигает больших размеров, приводящих к ее разрыву [Kanegane H. e.a.,1995,1997]. Поражение других органов и систем наблюдается редко. Имеются единичные указания на развитие пневмоний в начале заболевания, но диагностировать их можно только рентгенологически. У больных отмечается приглушение тонов сердца, в ряде случаев на ЭКГ регистрируется диффузное поражение миокарда [Блюмкин В.Н., Жданов В.М.,1973].

Язык обычно обложен белым налетом, влажный, иногда бывает тошнота, рвота. Большинство больных жалуются на вялость, головную боль, бессонницу [Мордовец В. И, Рудакова Р. И., Гуськова Т. Б.1986; Gosselin J. e.a.,1991].

У больных ОИЗ с МПС наблюдается подобная картина заболевания: лихорадка, аденопатия, нарушение носового дыхания, ангина, увеличение размеров печени и селезенки. Ангина с наложениями на миндалинах, как правило, сопровождалась реакцией регионарных лимфоузлов, степень увеличения которых соответствовала поражению зева.

1.2. Картина крови при ИМ

Картина крови при ИМ является самым достоверным диагностическим критерием [Anagnostopoulos I. e.a.,1995]. Общепринятым является мнение о том, что для ИМ характерна триада симптомов со стороны белой крови: умеренный лейкоцитоз, резкий мононуклеоз и качественное изменение мононуклеаров - появление атипичных клеток (АМ) [Gratama J.W. e.a.,1994].

Анемия не характерна для болезни Филатова, но в разгар заболевания гемоглобин обычно падает на 10-15 единиц [Гаспарян М.О., Шиленкова В.И.,1972; De Paoli P. e.a.,1990]. Общее количество лейкоцитов либо оставалось нормальным на протяжении всего заболевания, либо умеренно повышалось. Чаще всего лейкоцитоз отмечался на 1 день болезни. Иногда у детей раннего возраста незначительно повышалось количество эозинофилов. Эозинофилия наиболее отчетливо выявляется на 2, 3 и 4 неделе болезни [Joseph G. e.a.,1994].

Отмечается небольшое увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов. Палочкоядерный сдвиг наблюдается у детей всех возрастных групп, однако если у детей раннего возраста он отмечался в 60% случаев, то у детей более старшего возраста (после трех лет) в 83% [Балашева Т.Б. и соавт.,1996]. Количество сегментоядерных нейтрофилов у большинства больных оставалось в пределах нормы, реже количество этих клеток снижалось. Нейтропения наблюдалась главным образом у детей старшего возраста. У детей раннего возраста в период реконвалесценции (4-5 неделя болезни) нередко выявлялся нейтрофилез [Imreh M.P. e.a.,1995]. Количество нормальных лимфоцитов при ИМ у большинства детей уменьшалось. Наиболее часто уменьшение количества лимфоцитов отмечалось на 1 и 2 неделе болезни. Увеличение количества нормальных лимфоидных клеток наблюдалось значительно реже, чем лимфопении и нормальное их содержание [Гаспарян М.О., Шиленкова В.И.,1972]. Количество моноцитов у большинства детей, на протяжении всего заболевания, оставалось в пределах нормы. В 20-40% случаев наблюдается уменьшение количества моноцитов. Моноцитоз отмечался только в 15-30% случаев, наиболее отчетливо был выражен на 1 неделе болезни и чаще наблюдался у детей старшего возраста. Моноцитоз является одним из симптомов раздражения ретикуло-эндотелиальной системы [Котельников В.М. и соавт.,1982]. АМ обнаруживаются у всех обследованных. Чаще всего они выявляются на 1 неделе заболевания- 76-85% случаев, на 2 неделе- в 62-79%, на 3- в55-74% и на 4- в 20-50% случаев [Жибурт Е.Б. и соавт.,1996]. Более длительно АМ сохранялись в периферической крови у детей в возрасте от 1 до 3 лет [Beaulieur A.D. e.a.,1996].

Для детей с ОИЗ с МПС выявлена схожая гематологическая картина заболевани. Повышение АМ носило более сглаженный характер. В результате сравнительного изучения белой крови при ОИЗ с МПС и ИМ у детей в момент максимальной выраженности симптомов выявили ряд отличий [Мазурина Н.А. и соавт., 1996]. Так, при ОИЗ с МПС общее количество лейкоцитов было меньше, чем при ИМ, число сегментоядерных нейтрофилов почти в 2 раза больше, а содержание АМ в 2 раза меньше, чем при ИМ. При ОИЗ с МПС чаще всего наблюдается увеличение общего количества нейтрофилов и снижение содержания мононуклеаров. В то же время при ИМ всегда отмечается общий мононуклеоз и уменьшение общего количества нейтрофилов [Баринский И.Ф. и соавт., 1994]. Таким образом, несмотря на наличие АМ, при ОИЗ с МПС гематологические сдвиги отличаются от таковых при ИМ и могут быть использованы при дифференциации этих заболеваний [Выдумкина С.П. и соавт., 1999].

Электронно-микроскопическое исследование показало, что в периферической крови больных ИМ преобладают элементы лимфоцитарного и моноцитарного рядов. Специальное изучение морфологии АМ с помощью светового микроскопа показало, что ядро их чаще всего имеет неправильную форму, расположено эксцентрично. Структура ядра в одних клетках грубая, с просветлениями между глыбками хроматина, а в других ядерное вещество распределено равномерно, нередко с 1-2 нуклеолами [Lewin N. e.a.,1990]. Цитоплазма, как правило, обильная, в части клеток с неровными контурами, разнообразная по степени базофильности- от едва выраженной (“обесцвеченная цитоплазма”) до интенсивной, с перинуклеарной зоной или без нее. Иногда встречались клетки с выраженной “пенистостью” цитоплазмы [Nakata M. e.a.,1992]. Исследование поверхностной архитектоники моноцитов у больных ИМ проводилось в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания (4-15 сутки) [Anagnostopoulos I. e.a.,1995]. Исследование рельефа поверхности моноцитов у детей с ИМ выявило снижение содержания клеток с пузыреподобными структурами и переходным типом клеточной поверхности. Обращает на себя внимание значительное уменьшение в крови больных числа моноцитов с ворсинками и относительно гладкой поверхностью [Ютенко А.К. и соавт.,1994; Ribera E. Ocana I.,1989]. Количество же моноцитов с совершенно гладкой поверхностью мембраны, напротив, превышало нормальные значения. Кроме того, в крови детей с ИМ в большом количестве обнаруживаются моноциты с гребнеподобными структурами [Уразова О. И., Новицкий В. В., Помогаева А. П., Жукова О. Б., 2000]. Отличительной особенностью клеточного состава периферической крови у больных ИМ явилось присутствие клеток с неглубокими точечными впадинами на поверхностной мембране, которые не обнаруживались в крови здоровых детей [Турковская Н. Н.,1977]. Следует отметить также, что распределение моноцитов по типу их поверхностной мембраны у детей с легкой и средней степенью тяжести заболевания носило аналогичный характер. Таким образом, заболевание ИМ сопровождается выраженными перестройками структурной организации мембран моноцитов и появлением в крови инфицированных детей атипичных клеток, не встречающихся в норме [Новицкий В. В.,Уразова О. И., Антоненко Н. М., Жукова О. Б., 1999].

Методом сканирующей электронной микроскопии исследовали поверхностную архитектонику лимфоцитов у больных ИМ. Исследование проводилось в период развернутой клиникогенной картины заболевания (4-15 день) [Masucci M.C. e.a.,1987]. В крови детей, больных ИМ, среди лимфоцитов со сглаженной формой поверхностной мембраны преобладала популяция клеток с относительно гладкой поверхностью, а среди клеток с выраженным рельефом поверхности доминировали лимфоциты с ворсинками, что соответствовало показателям здоровых детей. Незначительно увеличивалось число гладких клеток и лимфоцитов с раффлами на поверхности мембраны [Beaulieur A.D. e.a.,1996]. Однако, содержание лимфоидных клеток со складчатой поверхностью существенно превышало их количество в контроле. Число же лимфоцитов с углублениями на поверхности мембраны у больных детей снижалось. Значительно реже обнаруживались клетки с пузыреподобными образованиями, переходным и комбинированным типом поверхностной мембраны [Жибурт Е.Б. и соавт.,1996; Joseph G. e.a.,1994]. У детей со средней степенью тяжести заболевания содержание клеток со складками значительно превышало значения аналогичного показателя у детей с легким течением инфекции. Особый интерес представляет факт увеличения в крови больных ИМ, особенно у детей со средней степенью тяжести заболевания, числа лимфоцитов со складчатой поверхностью [Lewin N. e.a.,1990]. По-видимому, наряду с нормальными лимфоцитами в эту группу клеток были отнесены “атипичные мононуклеары”, имеющие аналогичную структуру поверхностной мембраны.

Особый интерес представляет выявление в крови клеток, отличающихся по своей морфологической структуре присутствием на поверхности ворсинок, неправильной формой ядра с компактно расположенным хроматином, гипертрофией ядрышек, многочисленными рибосомами, повышенным количеством лизосом и митохондрий, вакуолизированной цитоплазмой. В ядрах ряда таких измененных клеток были обнаружены вакуоли правильной округлой формы, что позволяет предположить наличие вируса в данных клетках [Ютенко А.К. и соавт.,1994; Ribera E. Ocana I.,1989]. По всей видимости, данные клеточные элементы представляют собой так называемые “атипичные мононуклеары”, являющиеся трансформированными вирусом лимфоцитами, имеющими аналогичную структуру клетки [Gibbons D.L. e.a.,1994]. В крови больных ИМ превалировали макрофагоподобные моноциты, отличавшиеся от аналогичных клеток здоровых детей повышенным количеством вторичных лизосом, содержащих деструктивный материал, увеличением числа и величины митохондрий, повышенным содержанием и увеличением диаметра вакуолей комплекса Гольджи [Уразова О. И., Новицкий В. В., Помогаева А. П., Жукова О. Б., 2000].

Учитывая тот факт, что ИМ представляет собой реактивное заболевание, охватывающее всю ретикулогистиоцитарную систему, тщательному анализу была подвергнута система иммуноглобулинов [Gogusev J. e.a.,1988]. Показано, что гетерофильные антитела относятся к Ig M. синтез которых значительно повышен у больных ИМ; синтез IgG повышен незначительно, а IgA не изменены [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].

1.3.Апоптоз

1.3.1.Апоптоз как форма гибели клеток

Апоптоз впервые был описан J.F.R.Kerr и сотрудниками в 1972 году [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996]. В 1987 A.H.Wyllie сформулировал четыре основных элемента апоптоза:

1. Уменьшение объема апоптотирующей клетки;