Реферат: Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
3. Анализ параметров клеточного цикла
Благодаря фундаментальным исследованиям в области экспериментальной биологии и клинической медицины были получены факты, касающиеся кинетики клеточного цикла.
К настоящему времени уже накоплен определенный опыт работы по данному вопросу. Практически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма, экспериментального животного, который бы не подвергался цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу. На основании этих данных установлено, что содержание ДНК нормальных соматических клеток соответствует диплоидному набору хромосом (2с) и характеризуется одним модальным классом на ДНК-гистограмме. Значение этого параметра для одного и того же индивида может колебаться в пределах 30%. Наиболее выраженные вариации в содержании ДНК наблюдаются в клетках пролиферирующих органов – печени и селезенки. Эти данные были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб – по 5 – 14 от каждого случая)(E.Muller, R.Weidhase, 1983).
В изучаемых объектах схематически представлены фазы митотического цикла и распределение ДНК в различных тканях. Рассчитывалась кинетика клеточной пролиферации, а в патологически измененном органе – степень выраженности процесса, особенно в случае раковой опухоли.
Благодаря использованию в исследованиях сканирующих и проточных цитофотометров определены важные данные, касающиеся классификации клеток по фазам митотического цикла, а также получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и дисперсию соответствующих фаз цикла G1 , S, G2 +M.
Однопараметрический анализ кинетики клеточного цикла по изучению содержания ДНК показал возможности количественной цитометрии и открыл широкие перспективы относительно его использования для исследования и углубления знаний по изучаемому вопросу.
В настоящее время появились данные, которые значительно расширяют традиционное представление, касающееся распределения клеток в четырех последовательных фазах цикла. Одновременное изучение двух параметров – ДНК и белка, ДНК и РНК – дает существенно больше информации о кинетике клеточного цикла, так как позволяет разделить сливающиеся фазы цикла, такие, как G0 + G1 , G2 +M, а также идентифицировать дополнительные фазы в пресинтетическом (G1 ) и постсинтетическом (G2 ) периодах. При анализе пресинтетического периода в эксперименте и клиническом материале была показана возможность использования АО (ДНК и РНК) для дополнительной классификации G1 -периода на GIQ, GIA, GIB и G2A, G2B (Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980).
На культуре клеток Hela с использованием меченых радиоактивных изотопов и проточной цитометрии выделены в постсинтетическом периоде клетки, относящиеся к ранней (G2A) и поздней (G2B) фазам клеточного цикла (O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979).
Pollack и др. (A.Pollac, H.Moulis, N.L.Block, G.L.Irvin, 1984) при цитометрическом анализе ДНК и белка (FITC/PI) в клетках трех различных экспериментальных моделей, включающих культуру лейкозных опухолевых клеток крыс FL4, микрокультуру лимфоцитов периферической крови человека HPBL, не стимулированных и стимулированных фитогемагглютинином (ФГА), а также материала солидной опухоли в виде перевивной аденокарциномы предстательной железы крыс R 3327=Q показал возможность разделения пресинтетического периода на три фазы, выделив в нем покоящиеся клетки GIQ, ранние GIA и поздние G2B клетки, в постсинтетическом периоде были соответственно выделены ранние G2А и поздние G2B клетки. Для задержки вхождения клеток в S-фазу использовали актиномицидин D, оксимочевину, для блока митотических клеток применяли колцемид.
В работе также представлены данные, свидетельствующие о возможности классификации пролиферирующих лимфоидных и лейкозных опухолевых EL4-клеток в различные сроки культивирования на соответствующие S-фазы клеточного цикла с раздельным выделением в них M- и G2 -фаз. Исходя из представленных данных, очевидно, что проточный цитометрический анализ по двум параметрам является одним из перспективных методов оценки кинетики клеточного цикла, позволяющий провести идентификацию клеток, находящихся в ранее неопределяемых фазах цикла (G1A, G1B и G2A, G2B), и определить клетки, находящиеся в фазах M и G2 .
В некоторых работах клинического направления используется двухпараметрический анализ клеточного материала с достаточно успешной классификацией патологических процессов, например при распознавании доброкачественных и раковых процессов мочевого пузыря, шейки матки, а также для классификации различных форм гемобластозов.
В современной литературе весьма широко представлены данные по цитоспектрофотометрическому изучению интерфазных ядер. Следует отметить, что особую ценность представляют работы, направленные на изучение митотических клеток с последующим анализом хромосом. Известно, что изменения, регистрируемые в хромосомах, могут быть определяющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на начальных этапах возникновения злокачественного процесса. Однако используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно сложны и трудоемки. Поэтому в последнее время наряду с обычными цитогенетическими методами исследования кариотипа нормальных и малигнизированных клеток стали применяться сканирующие и проточные цитометрические анализаторы. Приборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорость измерения, а также воспроизводимость результатов. Скорость анализа хромосом в протоке составляет 1000 – 2000 хромосом в секунду. Проточный цитометрический анализ ДНК метафазных хромосом в суспензии является совершенно новым методом кариотипирования. Поэтому в исследованиях такого рода основной акцент делается на разработке эффективных методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры.
В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток. Для анализа генетического материала используются однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя флуорохромами. Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и хромомицин А3 , селективно взаимодействующий с ГЦ-парами.
Данные, полученные при помощи автоматизированных систем, представляются в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками, относящимися к различным классам хромосом. Количество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного (J.A.Steinkamp, 1984).
Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека. Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы находился между 19 и 20 хромосомами, в других – между 20-й и 17-й. В 70% случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й.
Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому. Применение двухлазерной системы (FACS-11) позволяет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985). В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий краситель: нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.
Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).
4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.
При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА.
Дезагрегация свежих солидных опухолей
Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:
– методы, основанные исключительно на механической обработке;
– ферментативные методы;