Реферат: Корекція екпериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження структурно-функціональних характеристик моно- і комбінованих органотипових культур щитоподібних, надниркових залоз і гіпофіза in vitro та in vivo - за умов трансплантації тваринам з післяопераційним гіпотиреозом.
Відповідно до встановленої мети передбачалося:
1. Дослідити дію специфічних і неспецифічних модифікаторів гормонопоезу на гормональну активність органотипових культур щитоподібних залоз (ОКЩЗ) in vitro.
2. Вивчити вплив органотипових культур надниркових залоз (ОКНЗ), експлантатів гіпофізу на гормональну активність та життєздатність тироцитів за умов комбінованого культивування.
3. Дослідити гормональний рівень і деякі показники білкового, ліпідного та вуглеводного обмінів у щурів з післяопераційним гіпотиреозом при ауто-, ало- і ксенотрансплантаціях комбінованих і монографтів нативних фрагментів (НФ) і ОКЩЗ.
4. Оцінити перевагу методу комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин в якості способу передобробки трансплантаційного матеріалу.
5. Провести гістологічний аналіз трансплантаційного матеріалу на етапі передобробки та після трансплантації.
Об’єкт дослідження - тиреоїдний статус і процеси метаболізму у гіпотиреоїдних щурів після ауто-, ало- и ксенотрансплантації НФ і ОКЩЗ в комбінації з НЗ і експлантатами гіпофізу.
Предмет дослідження - нативні фрагменти і органотипові культури щитоподібних залоз новонароджених поросят і статевозрілих щурів (самок) in vitro та in vivo (ауто-, ало- і ксенографти).
Методи дослідження - органотипове культивування, комбіноване культивування, ретроградний спосіб тиреоїдектомії, метод трансплантації під капсулу нирки, радіоімунологічний аналіз (РІА), фотоколориметричний метод визначення біохімічних показників крові, світлова мікроскопія, гістологічний аналіз, математичний аналіз результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові дані про стимулюючий вплив глюкокортикоїдних гормонів на Т4-гормонопоез in vitro. Встановлена концентраційна залежність рівня Т4 від кортикостерону в середовищі культивування ОКЩЗ щурів. Підтверджено здатність ОКЩЗ щурів і новонароджених поросят відповідати на дію специфічних і неспецифічних стимуляторів гормонопоезу шляхом підвищення рівня тироксину в середовищі культивування.
Удосконалено методику органотипового культивування ЩЗ. Розроблено метод комбінованого культивування тканин ЩЗ і НЗ та встановлено позитивний ефект останнього на морфофункціональні властивості ОКЩЗ in vitro та за умов трансплантації гіпотиреоїдним щурам.
Підібрані комбінації ендокринних тканин, при сумісному культивуванні та трансплантації яких, спостерігалося максимальне підвищення рівня тироксину в інкубаційному середовищі та його нормалізація в плазмі крові тварин-реципієнтів.
Дістало подальшого розвитку вивчення впливу гормонів гіпофізу на морфофункціональні характеристики ЩЗ in vitro (показано вірогідне зростання рівня тироксину при комбінованому культивуванні тканин ЩЗ і гіпофізу). За умов комбінованої трансплантації даних тканин визначено локальну стимулюючу дію на гормональну активність графту ЩЗ і наявність регуляторних зв’язків в межах гіпоталамо-гіпофізарно-тиреоїдної системи реципієнта, що підтверджується співвідношенням рівнів тиротропіну (ТТГ) і тироксину в плазмі крові гіпотиреоїдних тварин та гістологічними дослідженнями трансплантатів.
Вперше проведена спроба трансплантації комбінованих культур щитоподібних і надниркових залоз з метою гормональної корекції експериментального гіпотиреозу та супутніх метаболічних порушень. В загальну методику трансплантації ЩЗ введено етап передтрансплантаційної обробки матеріалу, на якому проводилось комбіноване культивування тканин ЩЗ, НЗ і гіпофіза. Встановлено позитивний ефект трансплантації комбінованих культур, ксенотрансплантації нативних фрагментів ЩЗ і НЗ в нормалізації рівнів тироксину, ТТГ і деяких біохімічних показників в плазмі крові тварин-реципієнтів.
Практичне значення одержаних результатів. Позитивні результати використання комбінованого органотипового культивування тканин ЩЗ, НЗ і гіпофізу в даному дослідженні обґрунтовують доцільність практичного застосування зазначеного методу на етапі передобробки трансплантаційного матеріалу з метою поліпшення його гормональної активності, зниження імуногенності та подовження термінів функціонування графту в організмі реципієнта.
Можливе клінічне застосування методу комбінованої трансплантації тканин щитоподібних і надниркових залоз в лікуванні первинного гіпотиреозу лабільного перебігу, в стадії декомпенсації, при неефективності терапії синтетичними гормональними монопрепаратами (L-тироксин), з огляду на відсутність в патогенезі захворювання аутоімунного компонента, а також для лікування первинного гіпотиреозу з супутньою недостатністю надниркових залоз, що виникла на тлі глюкокортикоїдної терапії.
Нові дані щодо компенсаторного впливу комбінованої трансплантації двох видів ендокринних тканин мають значення для розвитку тканинної та клітинної трансплантології, клінічної та експериментальної ендокринології і ендокринної хірургії.
Встановлення стимулюючої дії кортикостерону на Т4-гормонопоез in vitro та in vivo, наявності сигнально-регуляторних зв’язків між ЩЗ та гіпофізом, як в моделі in vitro, так і за умов трансплантації сприятимуть розвитку сучасних уявлень про взаєморегуляцію ендокринних залоз.
Результати досліджень використовуються у навчальному процесі при викладанні дисципліни “Фізіологія сільськогосподарських тварин”, розділу “Фізіологія ендокринної системи” студентам факультету ветеринарної медицини Сумського національного аграрного університету та можуть бути використані для викладання курсів нормальної,
патологічної фізіології та ендокринології на біологічних факультетах університетів та у медичних вищих учбових закладах, а також у роботі науково-дослідних установ ендокринологічного профілю.
Особистий внесок здобувача. Представлені на захист положення і експериментальні дані отримані при безпосередній участі дисертанта, яка полягає в самостійному плануванні дослідження, проведенні серії експериментів in vitro та in vivo, розробці та застосуванні методу комбінованого культивування, інтерпретації і математичному аналізі отриманих результатів, формулюванні висновків.
Автор висловлює подяку співробітникам відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи викладені та обговорені на засіданнях відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та на засіданні вченої ради біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна; матеріали дисертації представлені на наукових конференціях: IІІ и IV Данилевських читаннях (Харків, 2004, 2005 р.р.), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004 р.), конференціях молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2004, 2005 р.р.), 5th Parnas Conference "Molecular Mechanisms of Cellular Signalling" (Kyiv, 2005), конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005 р.), науково-практичній конференції з участю міжнародних фахівців “Актуальні питання абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів” (Київ, 2006 р.), 18th European Student’s Conference “Promising Medical Scientists Willing to Look Beyond” (Berlin, 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, у тому числі 6 статей, 4 із яких – у фахових виданнях, 10 тез доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 167 сторінках друкованого тексту, в тому числі на 29 сторінках цитована література, проілюстровано 23 рисунками, 4 таблицями і 31 мікрофотографією. Дисертаційна робота містить вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення), висновки і бібліографічний список, який включає 295 джерел, в тому числі 236 іншомовних.
Основний зміст роботи
Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на щурах лінії Вістар (самках), віком 3 місяці, вагою 165-215 г, використаних в якості реципієнтів для проведення ауто-, ало- і ксенотрансплантацій. Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, вимогам та нормам 1СН С8Р (2002 р.), типовим положенням з питань етики МОЗ України № 281 від 1 листопада 2000 р., відповідно до положень нормативних документів, введених в дію наказом МОЗ України № 6 від 17 січня 1995 р., а також вимогам “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та наукових цілях” (1986 р. № 123).
Трансплантаційний матеріал, у вигляді комбінованих і монографтів, представлено НФ і органотиповими культурами ендокринних залоз (ЩЗ, НЗ і гіпофізу) статевозрілих щурів і новонароджених поросят (НП). На етапі передобробки трансплантаційного матеріалу проводилось органотипове культивування ендокринних тканин, комбіноване культивування і культивування в присутності модифікаторів гормонопоезу. Для цього в асептичних умовах отримували органні фрагменти із ендокринних залоз щурів і новонароджених поросят розміром 0,5-1 мм3 , культивували їх за стандартною методикою (Грищенко В.І. та ін., 2000 ) протягом 4 діб на живильному середовищі 199/RPMI, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75 мкг/л) з додаванням пеніциліну (100 ОД/мл) і канаміцину/стрептоміцину (100 мкг/мл) при температурі 37 єС в атмосфері 5% СО2 . Для комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин на 3 добу фрагменти ЩЗ і НЗ, а також ЩЗ і експлантати гіпофізу відокремлювали напівпроникливою мембраною і інкубували 24 години, дотримуючись стандартних умов. Для визначення здатності ОКЩЗ відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу культивування в середовище додавали ТТГ (10 мкМО/мл (Sadeh K. et al., 1991 )) та інкубували 12 годин при температурі 37єС, тиротропін-рилізинг гормон (ТРГ) в 2 концентраціях (10 нмоль (4,4 нг/мл)) – на 12 годин (Weintraub B.D. et al., 1990 ) і 200 мкг/мл – на 2 години інкубації (Cheolyoung P. et al., 2005 )), дибутирил-циклічного аденозинмонофосфату (дб-цАМФ) (1 ммоль/мл), кортикостерон (в діапазоні концентрацій від 0,25 до 1,0 мкг/мл (Резников А.Г., 1980 )). Крім того, ОКЩЗ і ОКНЗ окремо культивували в стандартних умовах протягом 3 діб, а потім інкубували 12 годин, відокремлюючи фрагменти напівпроникливою мембраною в присутності ТТГ і дб-цАМФ у вищезазначених концентраціях. ОКЩЗ і експлантати гіпофіза інкубували з ТРГ (4,4 нг/мл – 12 годин і 200 мкг/мл – 2 години).