Реферат: Медицинская биохимия. Основные принципы измерительных технологий в биологической химии

Седиментационный анализ – разделение веществ в ультрацентрифуге под действием центробежной силы. В связи с различными величиной и плотностью исследуемых частиц они осаждаются при разных ускорениях.

Изучение состава и структуры вещества биологической природы и особенностей его обмена невозможно без использования сложных физико-химических методов и точных измерительных приборов. Создание этих приборов стало возможным после разработки таких методов исследования как гидролиз, хроматография, электрофорез, рентгеноструктурный анализ. В клинических биохимических лабораториях широко используются различные модели электрофотоколориметров, спектрофотометров, флюориметров, а также аппаратов электрофореза, аминокислотных анализаторов, автоматического коллектора отбора фракций, колоночной хроматографии.

Рассмотрим подробнее эти методы:

Электрофорез – этот метод основан на том, что в электрическом поле молекулы вещества, которое обладает электрическим зарядом, будут передвигаться к катоду или аноду. Скорость и направление их передвижения зависят от величины заряда молекулы, ее формы, размера.

Например, если смесь белков поместить в электрическое поле, то белки с положительным зарядом будут перемещаться в сторону отрицательного электрода, а белки с отрицательным зарядом – в сторону положительного электрода, белки же с нулевым зарядом останутся на месте старта. Белки с более высокой плотностью заряда будут двигаться по направлению к соответствующему электроду быстрее, чем белки с более низкой плотностью заряда.

Электрофорез проводят: в растворах, на носителях- полоска бумаги, пленки ацетата или целлюлозы, пластинах гидрофильного геля, трубочках, заполненных гелем.

Пример:

Стеклянные трубочки помещают в прибор для электрофореза. Заполняют их гидрофильным раствором, который полимеризуется и превращается в гель. На поверхность геля наносят смесь белков или аминокислот, затем прибор подключают к источнику тока. Через определенный промежуток времени происходит разделение смеси. Гель извлекают из трубочек и анализируют на денситометре.

Хроматография – сущность метода заключается в том, что различные вещества обладают различной способностью адсорбироваться на определенных веществах. Вещества разделяются между двумя фазами: подвижной и неподвижной. При этом весь процесс разделения складывается из многократных актов перехода вещества из одной фазы в другую.

Какие бывают виды хроматографии?

Распределительная – процесс разделения происходит вследствие различной растворимости.

Адсорбционная – разделение происходит вследствие различной сорбируемости веществ на поверхности твердой фазы (колоночная хроматография, гель-фильтрация, т.е. разделение веществ в зависимости от их молекулярного веса и размера молекул, колонка представляет собой как бы молекулярное сито).

Ионообменная – происходит в результате обмена ионов. Метод основан на различных кислотно-основных свойствах разделяемых веществ.

Химическая – например, комплексообразование или осадочная хроматография.

В лабораторной диагностике хроматография используется для разделения смесей аминокислот, а также для идентификации и количественного определения разделенных аминокислот. Основан на различиях кислотно-основных свойств аминокислот.

Пример:

Хроматографическая колонка представляет собой длинную стеклянную, заполненную гранулами синтетической смолы трубку, которая содержит прочно связанные с ней заряженные группы:

- смолы со связанными анионными группами - катионообменные

- смолы со связанными катионными группами - анионообменные

В наиболее простом варианте ионообменной хроматографии разделение аминокислот осуществляют на колонке с катионообменной смолой, в которой связанные анионные группы, например, остатки сульфоновой кислоты ( - S0₃ ^- ) сначала “нагружают” ионами Nа⁺ , затем на поверхность смолы наносят кислый раствор (рН 3,0), содержащий анализируемую смесь аминокислот и медленно пропускают через колонку. По мере прохождения через колонку положительно заряженные аминокислоты вытесняют ионы Nа⁺ , связанные с группами - S0₃ ^- ,которые прочно присоединены к частичкам смолы. Выходящий из нижнего конца колонки раствор (элюат) собирают в виде небольших порций (фракций) и определяют количество содержащихся в них аминокислот.

Этот процесс может быть автоматизирован. Запись показаний и анализ осуществляется на анализаторе.

Другая разновидность хроматографии - гель-фильтрация. В этом случае колонка заполняется очень мелкими пористыми гранулами высокогидратированного полимера. Раствор смеси аминокислот пропускают через колонку. Молекулы белков, имеющие сравнительно небольшие размеры, проникают через поры внутрь этих гранул, в результате чего их прохождение через колонку замедляется, тогда как молекулы крупных белков не могут проникнуть внутрь гранул и проходят через колонку значительно быстрее. Таким образом колонка является молекулярным ситом. Элюат собирают порциями и анализируют.

Для исследования структуры веществ и изучения химических превращений используется спектроскопия. При исследовании биологических объектов преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Эти методы позволяют обнаружить незначительные количества веществ.

Оптические методы количественного анализа позволяют регистрировать изменения, происходящие с лучом света при прохождении его через исследуемый раствор, а также измерение излучения молекул исследуемого вещества.

Спектр – это зависимость количества поглощенной или излученной системой энергии от длины волны или другого параметра (например, волнового числа).

Спектр поглощения является специфической характеристикой различных соединений при прохождении через них световой энергии. Спектр может быть получен в видимой ( 400-800 нм), ультрафиолетовой (200-400 нм) или инфракрасной области (800нм-5 мкм). Отдельные пики в спектре соответствуют длинам световых волн, которые поглощаются этим соединением, причем самый большой пик соответствует длине волны с максимальным поглощением.

Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн и поэтому их спектры лежат в различных областях. Электронные спектры обусловлены переходом электронов наружных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой.

Спектроскопия в видимой и ультрафиолетовой областях. Принцип – энергетический переход внешних электронов в молекулах. Применяется при количественных определениях ферментов и кинетических исследованиях.

Спектрофлуориметрия . Принцип – испускание света, длина волны которого больше чем длина волны поглощенного света. . Применение – количественный анализ, кинетика, качественный анализ.