Реферат: Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій на основі дослідження протимікробних властивостей похідних тіазолідину, фурану, хіноліну, акридину і біологічно активних речовин природного походження

Виявлення нових видів лікарської рослинної сировини, що є джерелами сполук з високим рівнем прямої протимікробної активності відносно MRS, антиадгезивними, імуномодулюючими властивостями та низьким рівнем цитотоксичності відкриває широкі перспективи для розробки вітчизняних фітопрепаратів. Завершено доклінічне дослідження нового ефективного протимікробного засобу – настоянки бруньок берези (Патент України UA № 27940).

В межах первинного етапу складного багатостадійного процесу створення нового фармацевтичного засобу охарактеризовано синтетичні сполуки (L-131, M-116), які володіють значною протимікробною активністю відносно MRS і низьким рівнем токсичності. Вказані сполуки, а також похідні 2-(5-арил-2-фурил) - 4-хінолінкарбонових кислот (Патент України UA № 23769) і четвертинні солі N-феніл-6-(p-диметиламінобензиліден) циклопента [с] хінолінію доцільно використовувати для конструювання антисептиків і дезинфектантів.

Результати дослідження теоретично обгрунтовують новий напрямок подолання антибіотикорезистентності стафілококів – комбіновану хіміотерапію із застосуванням модифікаторів резистентності синтетичного або природного походження. Розроблено оригінальну просту і достатньо чутливу методику для скринінгу сполук (як природного, так і синтетичного походження) на здатність відновлювати чутливість резистентних штамів мікроорганізмів до класичних антибіотиків (Патент України UA 27939).

Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів, фармацевтів і біологів на кафедрах вищих навчальних закладів та в системі післядипломної освіти (Львівський і Вінницький національні медичні університети, Івано-Франківський, Буковинський, Тернопільський, Одеський медичні університети, Львівський національний університет ім. І. Франка, Прикарпатський державний університет), для контролю за якістю протимікробних фітопрепаратів при їх виробництві.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно провів патентно-ліцензійний пошук, сформулював тему і мету, розробив методологію виконання роботи, оформив усі наукові публікації, написав усі розділи дисертації, сформулював висновки та практичні рекомендації.

Вивчені у дисериаційній роботі гетероциклічні сполуки синтезовані вітчизняними хіміками: проф. Р.Б. Лесиком на кафедрі фармацевтичної, органічної і біоорганічної хімії Львівського Національного медичного університету ім. Д. Галицького (похідні тіазолідину і споріднені гетероциклічні структури), проф. М.Д. Обушаком на кафедрі органічної хімії Львівського Національного університету ім.І. Франка (похідні тіазолідину, тіазолу, фурану, хіноліну), доц. М.В. Мельник на кафедрі біологічної і біонеорганічної хімії Івано-Франківського державного медичного університету (похідні оксополігідроакридинів) і доц. З.Л. Новицьким на кафедрі хімії фармацевтичного факультету Івано-Франківського державного медичного університету (четвертинні солі циклопента [с] хінолінію). Заготівлю рослинної сировини, її ідентифікацію та екстрагування здійснено автором особисто. Автор висловлює подяку доц. Б.М. Зузуку (кафедра фармакогнозії і ботаніки фармацевтичного факультету Івано-Франківського державного медичного університету) за цінні поради з оптимізації способів та режимів екстрагування рослинної сировини.

Особисто здобувачем за робочою документацією клінічних бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних закладів м. Івано-Франківська і області виконано епідеміологічний аналіз стафілококових інфекцій, вивчено закономірності поширення антибіотикорезистентних (в тому числі метіцилінрезистентних) стафілококів у регіоні. У бактеріологічній лабораторії кафедри мікробіології Івано-Франківського державного медичного університету від пацієнтів з гнійно-септичними і запальними процесами різноманітної локалізації здобувачем особисто впродовж 2000-2006 рр. виділено 360 штамів стафілококів. Вказані ізоляти, а також 170 штамів стафілококів, які були передані у лабораторію кафедри для подальшого вивчення з бактеріологічної лабораторії Івано-Франківської ОКЛ та міської централізованої бактеріологічної лабораторії, особисто здобувачем ідентифіковані, досліджені на чутливість до сучасних антибіотиків, антисептиків, дезинфікуючих засобів і офіцинальних фітопрепаратів. Самостійно встановлено механізми резистентності клінічних штамів до оксациліну, макролідів, тетрациклінів, фторхінолонів. Автором особисто відібрано і підготовлено до депонування в національних колекціях 36 клінічних штамів стафілококів (17 штамів S. aureus і 19 штамів CNS) з різними профілями антибіотикорезистентності. Самостійно розроблено алгоритми пошуку синтетичних і природних сполук з протимікробною активністю відносно MRS, відібрано типові клінічні ізоляти стафілококів для використання в якості тест-штамів при первинному мікробіологічному скринінгу, сформовано репрезентативні панелі штамів для поглиблених мікробіологічних досліджень.

Особисто здобувачем виконано первинний мікробіологічний скринінг 316 нових синтетичних сполук і 359 рослинних екстрактів з використанням в якості тест-культур колекційних і відібраних клінічних штамів MS - та MR-стафілококів різної видової належності. Самостійно визначено рівні протимікробної дії найбільш перспективних за результатами первинного скринінгу сполук і рослинних препаратів на сформованих панелях 50-150 клінічних штамів стафілококів з різними профілями і детермінантами антибіотикорезистентності. Автором особисто здійснено узагальнення результатів мікробіологічного дослідження, аналіз залежності протимікробної активності синтетичних сполук від їх структури. На основі результатів аналізу "структура – активність" дисертантом самостійно сформульовано пропозиції для хіміків-синтетиків щодо напрямків оптимізації структур-лідерів, що забезпечило можливість одержання нових серій активних сполук для мікробіологічного тестування. Докінгові дослідження афінності 4-азолідонів до ензиму біосинтезу пептидоглікану MurB виконані при допомозі проф. Р.Б. Лесика на кафедрі фармацевтичної, органічної і біоорганічної хімії Львівського Національного медичного університету ім. Д. Галицького.

Здобувачем особисто розроблено стратегію пошуку в рослинній сировині сполук нового спрямування дії – модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій. Самостійно виконано дослідження синергізму протимікробної дії рослинних екстрактів і класичних антибіотиків відносно резистентних штамів стафілококів. Особисто вивчено вплив рослинних екстрактів на динаміку росту мікробних культур та адгезивні властивості стафілококів. Дослідження здатності рослинних екстрактів індукувати продукцію ендогенного IFN і TNF-a виконано за участю канд. мед. наук Н.М. Жолобак у відділі інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (зав. – докт. біол. наук., засл. діяч науки і техніки України, чл. -кор. НАН України, проф. М.Я. Співак).

Токсикологічні експерименти виконано за участю І.О. Нектєгаєва (Львівський Національний медичний університет ім. Д. Галицького) і проф. С.Б. Геращенка (Івано-Франківський державний медичний університет).

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації дисертації доповідались і обговорювались на ІX і Х з’їздах Товариства мікробіологів України (Чернігів, 2000; Одеса, 2004), 2-му з’їзді фтизіатрів і пульмонологів України (Київ, 1998), VІІ і VІІІ ювілейному з’їздах Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003; Івано-Франківськ, 2005), VII, ІХ і Х Конгресах Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Львів, Трускавець, 2000; Луганськ, 2002; Чернівці, 2004), на V Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених, приуроченому до 10-ї річниці незалежності України (Тернопіль, 2001), міжнародних конференціях пам’яті Р. Вейгля International Weigl Conference "Microorganisms in Pathogenesis and their Drug Resistance" (Lviv, 2003), "Chemistry of Nitrogen Containing Heterocycles" (Kharkiv, 2003), "Новые технологии получения и применения биологически активных веществ" (Алушта, 2002), "Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів" (Чернівці, 1999), міжнародних науково-практичних конференціях "Лекарства – человеку" (Харків, 2000), "Пробіотики – ХХІ століття: Біологія. Медицина. Практика" (Тернопіль, 2004), IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології "Актуальні питання фармакології" (Вінниця, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні досягнення фармацевтичної науки та практики" (Запоріжжя, 2006), XXІ Українській конференції з органічної хімії (Чернігів, 2007), науково-практичних конференціях з міжнародною участю "Сепсис: Проблеми діагностики, терапії та профілактики" (Харків, 2006), "Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів" (Тернопіль, 2006), "Сучасний стан і актуальні проблеми ортопедичної стоматології" (Івано-Франківськ, 2005), регіональній науково-практичній конференції "Антибіотикотерапія у внутрішній медицині і хірургії" (Івано-Франківськ, 2006), на Всеукраїнському науково-практичному семінарі "Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії" (Харків, 2004), 9-ій науковій конференції "Львівські хімічні читання – 2003" (Львів, 2003), науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф. Калини Георгія Платоновича "Розвиток санітарної мікробіології в Україні" (Чернівці, 2002), на науковій конференції, присвяченій 50-й річниці з часу заснування Івано-Франківської державної медичної академії (Івано-Франківськ, 1995), на підсумкових наукових конференціях Івано-Франківського державного медичного університету (1998, 2003, 2007), на засіданнях Івано-Франківського обласного товариства мікробіологів і епідеміологів.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 76 наукових робіт, серед них 37 статей у фахових наукових журналах і збірниках, рекомендованих ВАК України для публікації результатів дисертаційних досліджень, отримано 6 патентів України на корисні моделі і винаходи (і 1 позитивне рішення за заявкою на винахід), підготовлено до друку монографію.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 319 сторінках комп’ютерного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, 7 розділів власних досліджень з 40 рисунками і 63 таблицями, розділ аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновки, практичні рекомендації, список використаної літератури, який налічує 494 джерела (85 кирилицею і 409 латиною), а також 14 додатків, викладених у окремому томі на 289 сторінках.

Основний зміст роботи

У вступі проаналізовано фактори, які сприяють формуванню і поширенню поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів у сучасних умовах. Наголошується на відсутності у вітчизняних лікувальних закладах систем мікробіологічного моніторингу та протиінфекційного контролю, що призводить до порушення основних принципів застосування протимікробних препаратів. Обгрунтовано актуальність теми дисертаційного дослідження, викладено мету та завдання, які розв’язувались при його виконанні. Визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведено дані щодо апробації дослідження, вказано обсяг і структуру дисертації.

У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено проблему глобального поширення у світі MRSA і MR-CNS, охарактеризовано їх роль у виникненні опортуністичних та нозокоміальних інфекцій в сучасних умовах. Акцентовано увагу на механізмах метіцилінрезистентності стафілококів та їх асоційованої резистентності до антибіотиків інших груп, синтетичних хіміотерапевтичних засобів, антисептиків, дезинфектантів. Крім того, критично проаналізовано сучасні засоби і підходи до лікування інфекцій, спричинених MRS.

У другому розділі охарактеризовано матеріали, методи та обсяг виконаних досліджень. Із 1990 р. виконується постійний моніторинг за характером мікрофлори, що виділяється від пацієнтів у лікувальних закладах різного профілю м. Івано-Франківська і області. На основі комп’ютерної програми WHONET 5.1 (http: // www. who. int/drugresistance/whonetsoftware/en/) створена постійно поповнювана база даних, яка містить результати мікробіологічного дослідження різних видів клінічного матеріалу (включаючи антибіотикограми збудників) з докладною інформацією про відповідних пацієнтів. Проаналізовано результати вивчення чутливості до антибіотиків різних груп 9980 ізолятів стафілококів (4271 штамів, або 42,80% S. aureus і 5709 штамів, або 57, 20% CNS), виділених на Прикарпатті в 1990-2006 рр., досліджено епідеміологічні аспекти поширення MRS.

Для поглибленого мікробіологічного дослідження з визначенням профілів та детермінант антибіотикорезистентності відібрано 530 штамів стафілококів клінічного походження (в тому числі 204 штами S. aureus і 326 штамів CNS), які ідентифікували відповідно до рекомендацій 12-го видання "Визначника бактерій Берджі" за комплексом культуральних і біохімічних властивостей ("STAPHYtest 16", Lachema, Чехія). Крім того, в роботі використано 17 колекційних штамів стафілококів з Музею патогенних мікроорганізмів ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМНУ" (м. Харків). Чутливість клінічних і колекційних ізолятів до антибіотиків визначали дискодифузійним методом на середовищі Мюллера–Хінтона з 4% хлориду натрію згідно з рекомендаціями Національного комітету клініко-лабораторних стандартів (NCCLS) США (1999), а також методами серійних розведень в агарі (Красильников А.П., 1995) та бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).

Ідентифікацію метіцилінрезистентних штамів стафілококів здійснювали на основі визначення чутливості до оксациліну методом двократних серійних розведень в сольовому агарі Мюллера–Хінтона та виявлення пеніцилін-зв’язуючого білка PBP2ў (продукту гена mecA) методом латекс-аглютинації (Slidex® MRSA Detection, bioMerieux, Франція). Ідентифікацію ефлюксного механізму резистентності до фторхінолонів здійснювали на основі зміни чутливості ізолятів до ципрофлоксацину в присутності специфічних інгібіторів помпи NorA – 20 мкг/мл резерпіну (Gibbons S. etc., 2003) і 25 мкМ верапамілу (Ince D. і Hooper D. C., 2001). Ефлюксний механізм резистентності стафілококів до макролідів (помпа MsrA) виявляли за зміною чутливості штамів до еритроміцину в присутності суббактеріостатичної концентрації (0,5 мкМ/мл) арсенату натрію (Wondrack L. etc., 1996). Крім того, вивчали чутливість клінічних ізолятів стафілококів до тетрацикліну в присутності 30 мкг/мл резерпіну – неспецифічного інгібітора помпи TetK (Gibbons S. і Udo E. E., 2000; Gibbons S. etc., 2003). Протимікробні концентрації антибіотиків та їх комбінацій з відомими інгібіторами ефлюксних механізмів резистентності визначали мікрометодом серійних розведень в бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).

Виконано первинний мікробіологічний скринінг 316 нових синтетичних гетероциклічних сполук (похідних тіазолідину, тіазолу, фурану, хіноліну та акридину) і 359 рослинних екстрактів (з них 203 водно-етанольні, 156 – органічні) різних органів 155 культивованих і дикоростучих лікарських рослин флори України. Скринінгові дослідження виконано за допомогою розробленої мікромодифікації методу дифузії в агар. Активні препарати дослід