Реферат: Молекулярні механізми реалізації нейротропної дії вітаміну РР та його біологічно активних похідних

Передбачається, що нікотинамід може конкурувати за місця специфічного зв’язування NAD⁺ на синаптичних мембранах мозку щурів. Проте на сьогодні нема чіткої відповіді, яким є характер його нейромодуляторної дії in vitro. У зв’язку з цим у порівняльному аспекті вивчали ефекти NAD⁺ та NAm у синаптичних закінченнях з метою оцінки можливості залучення NAD⁺ -зв’язувального білка синаптичних мембран до механізму реалізації нейротропної дії вітаміну РР. Як виявилось, ефекти NAm (0,001-1 мМ) на мембранний потенціал та вивільнення серотоніну є значно менш вираженими ніж при внесенні відповідних концентрацій NAD⁺ (рис. 2). Недостатня ефективність NAm у проведеному порівняльному дослідженні свідчить про те, що його нейротропна дія як попередника біосинтезу NAD⁺ можливо опосередкується нейромодуляторними ефектами динуклеотиду через NAD-зв’язувальний білок.

2. Специфічне зв’язування [U-¹⁴ C]NAD⁺ синаптичними мембранами при цукровому діабеті 1 типу та за умов інтенсифікації біосинтезу NAD⁺ . У ході роботи важливо було з’ясувати ті функціональні та біохімічні порушення у ЦНС, які можуть впливати на NAD-модуляторну систему за цукрового діабету 1 типу. Подібно до зниження внутрішньоклітинного вмісту нікотинамідних динуклеотидів як спільної патобіохімічної ознаки багатьох захворювань нервової системи [MaieseK. ChongZ.Z., 2003; SkaperS.D., 2003], за діабету також виявлено зниження рівня NAD⁺ у головному мозку (на 30 %), таблиця. Очевидно, що дефіцит NAD⁺ не пов’язаний з посиленням фосфорилювання динуклеотиду, так як вміст NADP⁺ був також знижений на 23 %. Установлені за ЦД1 зміни у забезпеченості мозку нікотинамідними динуклеотидами можна цілком

Рис. 3. Активність полі-ADP-рибозополімерази у ядрах клітин головного мозку щурів за введення нікотинаміду та N-ГАМК (мкмоль інкорпорованої [U-¹⁴ C]ADP-рибози_* 10^-5 /хв на мг білка, M±m, n = 8-10)

пояснити виявленим посиленим використанням NAD⁺ як субстрату у процесах полі-АDP-рибозилювання ядерних білків в ході репарації ДНК. Продемонстровано більш ніж 20 % підвищення активності ядерної полі-АDP-рибозополімерази за діабету у порівнянні з контролем (рис. 3). Це відбувається одночасно з інтенсифікацією вільнорадикальних процесів у ЦНС, про що свідчить акумулювання у мозку первинних та кінцевих продуктів ліпопероксидації - відповідно дієнових кон’югатів (не наведено) та ТБК-активних продуктів (рис. 4). Не виключено, що одним з фізіологічно небезпечних наслідків виснаження внутрішньоклітинного пулу NAD⁺ , обумовленого інтенсифікацією NAD-залежного полі-ADP-рибозилювання ядерних білків, можна вважати паралельно встановлену за діабету нестачу ATP у мозку (таблиця).

Як видно з результатів дослідження, представлених на рис. 5 та 6, на тлі зниженого вмісту NAD⁺ за діабету має місце істотне, на 51 %, підвищення його специфічного зв’язування синаптичними мембранами у порівнянні з контролем, що здійснюється за рахунок підвищення кількості місць зв’язування NAD⁺ без зміни спорідненості білка-рецептора до нуклеотиду. Величина високоафінної компоненти зв’язування у контролі становить К_д = 0,33 мкМ (рис. 5).

Рис. 4. Вміст ТБК-активних продуктів у гомогенатах головного мозку щурів за введення нікотинаміду

Для оцінки залежності рецепції NAD⁺ від забезпеченості мозку нікотинамідними нуклеотидами у порівняльному аспекті досліджували короткотривалі (6 годин – час, за який досягається максимум біосинтезу динуклеотидів) та довготривалі (2 тижні) ефекти низької (20 мг/кг маси тіла) та високої (200 мг/кг) доз NAm та N-ГАМК за ЦД1. З’ясовано, що досліджувані сполуки у використаних дозах як за короткотривалого, так і за довготривалого введення приблизно однаково ефективно впливали на вміст NAD⁺ , фактично повертаючи його до рівня контролю. Однак, прямої залежності між вмістом NAD⁺ та його рецепцією синаптичними мембранами за різної забезпеченості нервової системи цим динуклеотидом ми не виявили. Отримані результати засвідчили відсутність будь-яких суттєвих ефектів сполук у досліджуваних дозах на зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами за їх короткотривалої дії.Досягнення фармакологічного ефекту вітаміну РР на відновлення рецепції NAD⁺ потребувало хронічного введення його високих доз (рис. 6), що поряд з можливістю безпосередньої взаємодії NAm з NAD-зв’язувальним білком, фактично свідчить про залучення механізмів більш опосередкованої та віддаленої у часі дії вітаміну на нейрохімічні процеси у нервових клітинах, які можуть бути пов’язані зі встановленими антиоксидантними властивостями NAm та N-ГАМК (рис. 4), а також з їх роллю як інгібіторів полі-АDР-рибозилювання білків (рис. 3).

Рис. 5. Зв’язування [U-¹⁴ C]NAD⁺ синаптичними мембранами в нормі та за умов діабету (A) та його графічний аналіз за Скетчардом (Б): 1-контроль; 2-діабет; 3- діабет + NAm (20 мг/кг), M ± m, n = 5

3. Стан серотонінергічної медіаторної системи за цукрового діабету та при введенні вітаміну РР. Оскільки з одного боку NAD⁺ та серотонін мають спільного попередника біосинтезу, триптофан, а з іншого – динуклеотид є модулятором серотонінергічної медіаторної системи, то виявлені зміни вмісту NAD⁺ у головному мозку та його рецепції синаптичними мембранами могли б призводити до змін у функціонуванні цієї нейромедіаторної системи. Установлено, що пов’язані з діабетом порушення синаптичної функціївключаютьзростання рівня спонтанного вивільнення міченого серотоніну (рис. 7), що супроводжується зниженням електрохімічного градієнту іонів у синаптичних мембранах нервових закінчень.

Рис. 6. Зв’язування [U-¹⁴ C]NAD⁺ синаптичними мембранами головного мозку щурів: 1 – контроль; 2 – діабет; 3 – діабет + NAm (20 мг/кг); 4 - діабет + NAm (200 мг/кг); 5 - діабет + N-ГАМК (200 мг/кг)

Деполяризація синаптосом KCl (25 мМ) або 4-амінопіридином (4-AP, 0,1 мМ) індукувала вдвічі більш істотне, на додаток до базального, вивільнення серотоніну за діабету у порівнянні з контролем (рис. 7б). При цьому вивільнений серотонін в обох випадках, імовірно, походить з одного і того ж везикульованого пулу медіатору. Підвищена відповідь синаптосом на дію деполяризаторів за цукрового діабету узгоджується з можливістю посилення за патології ендогенного фосфорилювання певних ефекторних білків апарату екзоцитозу (Shoji-Kasai Y.etal, 2002). Як введення NAm, так і N-ГАМКпризводило до часткової нормалізації процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але при цьому дія NAm була більш вираженою.

Рис. 7. Вивільнення [2-¹⁴ C]серотоніну синаптосомами головного мозку (а) за дії екзогенного NAD⁺ (1 мкМ); (б) 4-амінопіридину та KCl: 1 – відповідний контроль; 2 – 4-АР (0,1 мМ); 3 – KCl (15 мМ), M±m, n = 10-12

Доказом того, що індуковані цукровим діабетом порушення у функціонуванні центральних нейромедіаторних систем можуть включати зміни у нейромодуляторних процесах за участю NAD⁺ є те, що екзогенно доданий до суспензії навантажених [2-¹⁴ С]серотоніном синаптосом головного мозку діабетичних щурів NAD⁺ (1 мкМ) виявився не здатним у порівнянні з контролем істотно стимулювати вивільнення медіатору (рис. 7а). Отже, загальні зміни вмісту NAD⁺ у клітинах мозку та порушення процесу його специфічного зв’язування за діабету, напевно, негативно позначаються на ефективності механізму функціонального спряження рецепторної та/або трансдукуючої/ефекторної ланки у клітинному сигналингу NAD⁺ . Відновлення зв’язування супроводжувалось нормалізацією відповіді синаптосом на нейромодуляторну дію екзогенного NAD⁺ у групі тих діабетичних тварин, які отримували нікотинамід у дозі 200 мг/кг маси тіла.

4. Роль сигнального шляху G_s -білок/cAMP/протеїнкіназа А та процесів моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків у вивільненні серотоніну за ЦД1та при введенні вітаміну РР. Передача сигнальної інформації через NAD-зв’язувальний білокта нейрохімічні ефекти вітаміну РР і його біологічно активних похідних за умов ЦД1 можуть здійснюватись на рівні процесів, які пов’язані зі складною регуляцією синаптичної функції із залученням різних типів посттрансляційної модифікації функціонально важливих білкових молекул.Нами встановлено можливу патогенетичну роль активації сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа А та PKA-залежного фосфорилювання у порушенні вивільнення серотоніну за цукрового діабету, так як H89, специфічний інгібітор PKA, знижує in vitro вивільнення [2-¹⁴ С]серотоніну синаптосомами головного мозку діабетичних щурів (рис. 8).

Рис. 8. Спонтанне вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів за умов інгібування сАМР-залежної протеїнкінази invitro: 1 – контрольні щури; 2 – діабетичні щури; 3 – діабетичні щури, яким вводили нікотинамід (М ± m, n = 4-6)

Дія інгібітору РКА за двохтижневого введення NAm у дозі 200 мг/кг маси тіла нагадує його ефекти у недіабатичному контролі, що вказує на гальмування ендогенного фосфорилювання білків у механізмі нормалізації вивільнення серотоніну при введенні досліджуваної сполуки за ЦД1. У контексті вивільнення нейромедіаторів у літературі найдетальніше описано значення модифікації синаптичних білків саме шляхом фосфорилювання. Останнім часом з’являється дедалі більше даних стосовно його зв’язку з ендогенним моно-ADP-рибозилюванням білків, яке, імовірно, відіграє подібну роль [Ying W., 2006; Tsuyama S. et al, 1999]. Тому досліджували можливізміни моно-ADP-рибозилювання неядерних білків у взаємозв’язку з дисфункціями мозку, асоційованими з діабетом. Отримані нами результати свідчать, що рівень конститутивного моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків за діабету вищий на 34 % у порівнянні з контролем (рис. 9).

Рис. 9. Базальне та індуковане холерним токсином (СТХ) моно-ADP-рибозилювання білків синаптичних закінчень invitro: 1 – к