Реферат: Молекулярные механизмы сплайсинга

Сближенные концы интеина обозначены квадратом. Изображение получено из PDB-структуры 1AM2.

Современные представления о механизме белкового сплайсинга

Многими исследователями было показано, что белковый сплайсинг является аутокаталитическим процессом и для своего осуществления не требует присутствия ферментов или кофакторов. Однако определить точный механизм сплайсинга белков долгое время не удавалось — процесс происходит очень быстро, и обычными методами обнаружить промежуточные соединения не представлялось возможным. Главная проблема заключалась в том, что интеин в составе белка нельзя было даже выделить — сплайсинг проходил сразу после синтеза белка, и пока клетки собирались и лизировались — следов уже не оставалось. Решить эту задачу удалось группе Ф. Перлер (Francine Perler) довольно очевидным (как это теперь представляется) способом. Они изменяли ряд консервативных аминокислотных остатков в интеинах методом направленного мутагенеза. Как только мутации касались активного центра интеина — белковый сплайсинг блокировался на разных этапах, и в среде накапливались промежуточные продукты реакции. Например, изменение С-конца интеина вызывало накопление «разветвлённых» белков, у которых было... два N-конца. Исследование этих необычных белков и позволило предложить механизм белкового сплайсинга (см. рис. 3).

Рис. 3. Механизм белкового сплайсинга.

Событием, запускающим белковый сплайсинг, является автокаталитический N–O или N–S-сдвиг (первый аминокислотный остаток на N-конце интеина Ser или Cys, соответственно) на N-концевом сайте сплайсинга (шаг 1). В результате образуется высокореакционная эфирная или тиоэфирная связь.

С точки зрения химии, N–O/N–S-сдвиг не является энергетически выгодным процессом, поскольку в результате реакции происходит разрыв амидной (пептидной) связи и образуется высокоэнергетическая эфирная/тиоэфирная связь. Поэтому этот процесс должен катализироваться. Действительно, протекание реакции разрыва пептидной связи на N-конце облегчается как минимум двумя факторами. Во-первых, процесс катализируется самим сплайсинговым доменом интеина. Во-вторых, на эффективность N-концевого расщепления определенное влияние оказывают экстеины. Показано, что у некоторых интеинов пептидная связь, связывающая N-экстеин и первую аминокислоту интеина, находится в редкой и не характерной для белков цис-конформации. Поскольку такая связь энергетически невыгодна, ее наличие провоцирует протекание N–О или N–S сдвига, т. е. инициирует сплайсинг.

На втором этапе белкового сплайсинга происходит нуклеофильная атака образовавшейся эфирной связи OH- или SH-группой первого остатка С-экстеина. В результате происходит реакция трансэтерификации, т. е. перенос Н-концевого экстеина на боковую группу первого остатка С-экстеина (шаг 2). В результате образуется разветвленное промежуточное соединение (те самые белки с двумя N-концами, с помощью изучения которых был и предложен данный механизм сплайсинга). Такая перестановка приводит к смещению зарядов, что в свою очередь, индуцирует циклизацию боковой цепи Asn на С-конце интеина (шаг 3).

Циклизация боковой группы Asn приводит к разрыву пептидной связи между интеином и С-экстеином — разветвленная структура распадается на свободный интеин и лигированные экстеины, связанные друг с другом эфирной связью (шаг 3). Последний шаг сплайсинга белка происходит спонтанно (шаги 4а и 4б).

Согласно принятой на сегодня теории, белковый сплайсинг состоит из серии последовательных перестановок. Детальными исследованиями этих перестановок занимается российский ученый Старокадомский. Но самое удивительное, что помимо цис-сплайсинга (т. е. автокаталитического удаления интеина из белка-предшественника), у многих организмов обнаружено явление транс-сплайсинга. На пальцах это можно объяснить так: у двух белков на соответствующих концах есть по половинке интеина (назовем их интеин-подобные домены, ИПД), которые, соединяясь по типу «ключ-замок», образуют вполне функциональный интеин. А этот образованный интеин вырезает сам себя, сшивая два белка в единое целое. То есть, в результате транс-сплайсинга происходит сшивание двух белков, кодируемых двумя различными генами (рис. 4). И это не лабораторная экзотика: по такому механизму, например, происходит образование белка DnaE (одна из субъединиц ДНК-полимеразы) у Synechocystis sp.

Рис. 4. Механизм транс-сплайсинга.

Рис. 5. Предполагаемый механизм сплайсинга белков

а, б - альтернативные механизмы инициации сплайсинга, N, C - N- и C- концевые экстеины белков-предшественников

Эндонуклеазная активность интеинов

Следующей удивительной особенностью интеинов (правда, не всех) является их эндонуклеазная активность. Интеин обеспечивает (с определенными ограничениями) распространение своего гена в геноме клетки. Такой процесс, как мы уже говорили, и называется хоумингом интеинов. Другими словами, интеин-белок может амплифицировать (множить) количество своих генов в клетке. Также за счет этого свойства он может обеспечивать передачу интеинового гена другим особям данного вида или передавать другим видам (т. н. горизонтальный и вертикальный перенос соответственно). Причем эволюционный анализ распространения разных интеинов (а их открыто больше 1000, причем и у прокариот, и у низших эукариот) свидетельствует, что интеины распространяются довольно активно, и притом, оказавшись в разных видах, могут мутировать и менять последовательность. В общем, интеины в данном случае ведут себя подобно транспозонам или даже примитивным вирусам (если такое в принципе можно сказать про белки). Хотя... ряд вирусов также несет в себе интеины. Например открытый недавно гигантский Мими-вирус имеет интеин (APMV Pol) в гене ДНК-полимеразы.

Механизм хоуминга схематически показан на рис. 6. На самом деле, хоуминг — это не такая уж экзотика. Хоуминг-эндонуклеазы были известны еще до открытия интеинов. Это большой класс сайт-специфических ДНКаз, которые часто кодируются мобильными генетическими элементами.

Хоуминг интересен в первую очередь тем, что обеспечивает так называемый «горизонтальный» перенос гена — т. е. перенос последовательности в гомологичные области других видов. Осуществляется это, вероятнее всего, вирусами. Действительно, интеины чаще всего встречаются в белках, вовлечённых в метаболизм нуклеиновых кислот (полимеразы, лигазы, гиразы, хеликазы, белки репарации ДНК и т. п.). А ведь это те белки, которые присутствуют у вирусов и фагов! В общих чертах механизм горизонтального переноса можно описать так: дополнительные копии ДНК, которые появляются во время формирования новых вирусов, могут узнаваться как мишень для хоуминга. Интеин катализирует перенос своей последовательности в вирусную ДНК. Таким образом ген попадет в вирус, а вирус во время следующей инфекции может внести его в геном другого, близкого вида. Так гены интеинов могут путешествовать по видам. Однако тут стоит отметить, что распространяются они только между одноклеточными организмами — у многоклеточных они пока не найдены. Зато обнаружено несколько семейств ферментов и молекул, активирующихся по механизмам, похожим на белковый сплайсинг. Произошли ли они от предков интеинов или возникли самостоятельно — пока что неизвестно.

Рис. 6. Принципиальный механизм хоуминга интеинов.

Интеин катализирует двухцепочный разрыв в аллеле^(-) в точке интеиновой вставки. При этом образуется 3’-выступающий конец длиной 4 нуклеотида («липкий» конец). Далее клеточными ферментами проводится репарация двухцепочечного разрыва с использованием в качестве матрицы аллельной ДНК, содержащей последовательность интеина. Это обеспечивает его перенос в аллель^(-) . Поскольку исходной аллелью может быть и плазмидная, и вирусная ДНК, таким способом может обеспечиваться и горизонтальный перенос, что позволяет интеинам распространяться и сохраняться (или даже «выживать», если б такой термин можно было применить к полипептиду). Однако на самом деле процесс хоуминга происходит довольно редко в силу ряда обстоятельств.

Использование интеинов в биотехнологии

На мой взгляд, интеины являются одним из наиболее удачных и перспективных инструментов в биотехнологии белков и протеомных исследованиях. Мы коротко рассмотрим основные из методов, а также самые экзотические из них — например, создание белков-«колечек» или способ контроля размножения генно-модифицированных растений.

Очистка рекомбинантных белков

После открытия феномена белкового сплайсинга внимание исследователей сразу привлек факт самодостаточности интеина и точности его самовырезания. Т.е., если пришить интеин на уровне гена к интересующему нас белку (белок-Х), то теоретически мы сможем экспрессировать слитый белок (интеин–белок-Х), который при определенных условиях разрежется (интеин + белок-Х). Если же вставить интеин между двумя белками (белок-Х–интеин–белок-Y), то в результате можно получить сшитый двойной белок (белок-Х–белок-Y). Логичным является вопрос: а можно ли использовать для этих целей искусственный интеин с аффинной меткой (*–интеин)? Это бы позволило очистить полученный продукт (*–интеин–белок-Х), а потом отделить от белка-Х его метку (*–интеин). В результате мы получили бы целевой белок без каких-либо дополнительных модификаций. В целом интеин-опосредованная очистка предлагает все преимущества аффинной хроматографии (быстрая и эффективная очистка меченного белка), позволяя обойти главный недостаток этого метода — необходимость точного и стопроцентного отщепления аффинной метки от уже чистого препарата.

Тщательное исследование показало, что это действительно возможно. Сейчас созданы несколько систем на основе разных интеинов, которые несут His-tag, хитин-связывающий домен бактерий (CBD) и другие классические аффинные метки. Ряд из них уже коммерчески доступены (например системы IMPACT, IMPACT-СН, TWIN-IMPACT фирмы NEB). Аналогичные системы создаются и в России. Потенциал таких технологий огромен — в первую очередь потому, что позволяет упростить очистку рекомбинантного белка до одного этапа (против 4–5 этапов на ионно-обменных носителях, какие используются в многих фармацевтических производствах) и не требует изменений самого целевого белка (обязательных при использовании традиционных аффинных меток, которые внедряются в сам белок).

Использование белкового сплайсинга для создания биосенсоров

После открытия того, что с помощью интеина можно биологически приемлемо сшить два разных белка, начались работы по созданию нового типа биосенсоров. Главной проблемой в этой области является сложность иммобилизации сенсорного белка на поверхности (т. е. покрытие им поверхности сенсора так, чтобы белок не утратил работоспособности). С помощью интеинов можно «сшивать» между собой два разных белка, один из которых может служить молекулярным якорем, связываясь с нужной поверхностью, а второй — самим сенсором. Так, например, с помощью такой технологии удалось сшить мальтоза-связывающий белок (МВР) и Т4 ДНК-лигазу. В результате активность Т4-лигазы сохранилась, а пришитый МВР позволяет её закрепить или очистить на поверхности биосенсора. Другая технология — протеомный микроанализ (protein microarray) — требует создания матриц, на которых были бы ковалентно пришиты определённые белки-маркёры. Проблема заключается в том, что, с точки зрения технологичности (т.е. простоты хранения, транспортировки и использования), белки должны быть пришиты ковалентно. При этом они, естественно, не должны терять активности (что проблематично, поскольку на твёрдых поверхностях белки часто слипаются и инактивируются) и не содержать примесей (которые могут искажать результаты). Поэтому интеины как посредники, которые могут нативно сшивать целевой белок с любой поверхностью, модифицированную каким-то образом (например, покрытую недорогим серосодержащим полимером), являются весьма ценным инструментом. Первые работы в этой области уже дали довольно хорошие результаты. Эти работы позволяют надеяться, что в ближайшем будущем мы получим мощный инструмент для анализа белок-белковых взаимодействий и картирования протеома организма — ведь это, как известно, следующая глобальная задача после картирования генома.

Циклизация ферментов

Такое трудно даже представить. Однако это осуществлено — белок «скрутили в баранку» без начала, без конца. Для этого был использован феномен транс-сплайсинга, только интеин-подобные N- и С- домены находились не в разных белках, а на разных концах одного белка. Методика, с помощью которой возможно циклизировать белки, получила название SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular Ligation Of Peptide and ProteinS). Кстати, закольцованный таким способом фермент (со сложным названием дегидрофолатредуктаза), после этого не только не потерял своей активности, но даже наоборот — стал менее чувствительным к изменению температуры среды. А в промышленности, где из-за больших объемов температуру реакции контролировать намного сложнее, такие катализаторы будут очень востребованы.

Экспрессия токсичных для клетки продуктов

Часто эукариотические белки, экспрессируемые в клетках прокариот, убивают организм-продуцент. Это явление называется токсичностью. Из-за неё ряд практически важных белков (например, протеазы) в достаточных количествах наработать в бактериях не удается. Использование систем экспрессии на основе интеинов может решить эту проблему. Токсичные для клетки белки можно нарабатывать в виде неактивных химерных предшественников, слитых с интеинами. Последние нарушают структуру продукта и не дают ему активироваться. После наработки такие химерные белки очищаются и активируются путем индукции самоудаления интеина из их структуры.

Заключение

До сегодняшнего дня считается, что сплайсинг в живых клетках протекает непосредственно после трансляции. Это относится и к цис- и к транс-вариантам. Вероятно последним требуется какое то время для встречи и объединения ИПДоменов. Но в литературе отсутствуют данные о том, что в какой-либо клетке наблюдался пул белков с и без интеина - интеины обнаруживаются только после секвенирования генома.

В биотехнологии ситуация другая - в большинстве случаев именно требуются интеины, активностью которых можно было бы управлять. Это достигается заменой либо первого цистеина, либо последнего аспарагина на аланин. Кроме того, часто замена природных экстеинов на биотехнологические продукты уже тормозит активность интеина. Соответственно в обоих случаях мы можем выделить интеин-содержащий конструкт и потом активировать сплайсинг - чаще всего добавлением тиольных агентов, которые исполняют роль цистеина или серина.

Сплайсинг нуклеиновых кислот является одним из мощнейших способов быстрой перетасовки наследственной информации, что в некоторых случаях помогает живым организмам быстро приспособиться к изменившимся условиям. Поэтому его обнаружение у белков еще раз подтвердило универсальный для всего живого принцип «разумной бережливости» — удачные процессы, характерные для одних типов молекул, часто обнаруживаются и у других (в данном случае — и у нуклеиновых кислот, и у белков).