Реферат: Мутация вирусов, характеристика мутагенов
В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных для него условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39 - 42°С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36 – 37°С).
Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса.
По своему механизму мутации могут быть тоже разными. В одних случаях происходит делеция, т. е. выпадение одного или нескольких нуклеотидов, в других – происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях – замена одного нуклеотида другим. [1]
Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные (реверсии) – его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит вместе первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при получении мутантов с заданными свойствами, например вакцинных штаммов, приходится считаться с возможной их реверсией к дикому типу.
Вирусы отличаются от остальных представителей живого мира не только своими малыми размерами, избирательной способностью размножаться в живых клетках, особенностями строения наследственного вещества, но и значительной изменчивостью. Изменения могут касаться величины, формы, патогенности, антигенной структуры, тканевого тропизма, устойчивости к физико – химическим воздействиям и других свойств вирусов. Значение причин, механизмов и характера изменения имеет большое значение при получении необходимых вакцинных штаммов вирусов, а также для разработки эффективных мер борьбы с вирусными эпизоотиями, в процессе которых, как известно, свойства вирусов могут существенно изменят одной из причин сравнительно высокой способности вирусов изменять свои свойства является то, что наследственное вещество этих микроорганизмов менее защищено от воздействия внешней среды.
Мутация вирусов может возникать в результате химических изменений цистронов или нарушения последовательности их расположения в структуре молекулы вирусной нуклеиновой кислоты.
В зависимости от условий различают естественную изменчивость вирусов, наблюдаемую в обычных условиях размножения, и искусственную, получаемую в процессе многочисленных специальных пассажей или путем воздействия на вирусы особых физических или химических факторов (мутагенов). [2]
В естественных условиях изменчивость проявляется не у всех вирусов одинаково. Наиболее ярко этот признак выражен у вируса гриппа. Значительной изменчивости подвержен вирус ящера. Об этом свидетельствует наличие большого количества вариантов у разных типов этих вирусов, и существенные изменения его антигенных свойств в конце почти каждой эпизоотии.
Частота мутаций и механизмы их возникновения
Мутации бактериофагов изучались очень интенсивно не только с целью генетического анализа, но и для получения информации о свойствах самих фагов. Частота появления тех или иных мутантов в фаговом потомстве варьирует в весьма широких пределах: например, некоторые мутанты образуются с частотой не выше 10 , тогда как другие возникают с частотой 10 и выше. Неблагоприятный эффект высокой частоты мутаций обычно компенсируется действием отбора. Например, мутант фага может быть вытеснен диким типом, который дает больший выход фага.
Высокая частота вспонтанного возникновения обычно характерна для таких мутаций, которые могут происходить во многих сайтах одного локуса. В тех случаях, когда нормальный признак соответствует функциональной форме гена, а мутантный появляется в результате какого-то изменения в любой точке данного локуса, частота прямых мутаций будет выше, чем частота обратных, так как обратные мутаций должны приводить к восстановлению нормального состояния. Иногда ревертанты оказываются на самом деле псевдоревертантами: это происходит либо в результате изменений в каком-либо другом гене (супресорные мутации), либо вследствие изменений в том же гене, которые обусловливают иную, но также активную форму продукта.
У зрелых фаговых частиц частота вспонтанных мутаций очень низка, но их можно идуцировать, воздействуя какими-либо мутагенными факторами, например рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами, азотистой кислотой, гидроксиламином или алкилирующими агентами. Азотистая кислота дезаминирует основания нуклеотидов, а этилметилсульфонат их этилирует. Гидроксиламин превращает щитозин в урацил. При зарожении модифицированными фагами вследствие ошибок, происходящих при репликации химически измененной нуклеиновой кислоты, возникают мутации, и потомство фага, высвобождающееся из одной бактерии, содеожит как нормальные, так и мутантные частицы. Однако, как и следует ожидать при обработке мутагеном фага, содержащего одноцепочечную ДНК, образуется чистый клон мутанта.
Изучение мутационного процесса, происходящего во время размножения фага, имеет большое прямое отношение к анализу развития фага. Сначала рассмотрим спонтанный мутационный процесс. В бактериальной клетке, в которой произошла мутащия фага, образуется как нормальный, так и мутантный фаг. Число мутантных фаговых частиц, содержащихся в популяции фага, выходящей из данной единичной бактериальной клетки, очевидно, определяется характером репродукщии фага, ибо новые гены могут образоваться лишь путем репликации предсуществовавших. Если вероятность данной мутации при каждой репликации одинакова, то число возникших мутантов зависит от механизма репликации. Например, если каждая новая копия гена образуется независимо от остальных, то распределение мутантных копий в потомстве фага из различных инфицированных бактерий будет случайным. Если же, напротив, каждая из образующихся копий будет в свою очередь репродуцироваться, то мутантные копии будут встречаться группами, или клонами, состоящими из мутантных «сибсов».
Для проверки этих предложений были проведены эксперименты. Бактериальные клетки заражали фагом Т2 и подсчитывали бляшки, образуемые мутантными частицами, - r-мутанты (вызывающие быстрый лизис). Затем находили распределение по частоте клонов, содержащих 1, 2, 3, . . .5,… мутантов, и сравнивали найденное распределение с рассчитанным, которое было основано на допущении, что воспроизведение фаговых генов – экспоненциальный процесс, состоящий из последовательных дупликаций, а вероятность мутирования гена при каждой репликации – величина постоянная. Если эти допущения справедливы, то следует ожидать, что частота y, с которой образуются клоны, содержащие
х(=2 ) мутантов, будет следующей:
где m – вероятность мутации, N – конечное число копий гена, а n – число генераций фаговых генов, полученных в данном опыте. Поскольку на практике геномы фага реплицируются несинхронно, удобнее анализировать распределение мутантов, исходя из частоты Yxобразования клонов, содержащих x или более мутантов:
Распределение, полученное в эксперименте очень хорошо совпадает с теоретическим, особенно если учитывать влияние, которое оказывает на результаты опыта ограниченная величина каждого выхода фага - сборки зрелых фаговых частиц из фонда реплицирующихся элементов. Из полученных данных следует, что репликация генов фага – экспоненциальный процесс, аналогичный размножению любого организма, которое происходит путем повторных делений. Конечно, эта аналогия носит чисто формальный характер и является просто следствием полу консервативного механизма репликации фаговой ДНК, т. е. результатом образования из каждой двухцепочечной молекулы ДНК двух новых двухцепочечных молекул. [3]
Интересная ситуация была обнаружена при анализе распределения мутантов, образовавшихся в результате обработки фага Т4 мутагеном этилметилсульфонатом. Оказалось, что клоны с 1, 2, 4, 8 мутантами встречались примерно с одинаковой частотой. Известно, что действие этого мутагена на фаговую ДНК состоит в этилировании гуанина. Поэтому полученные данные были интерпретированы в том смысле, что для каждого этилгуанина, входящего в состав ДНК, существует некоторая постоянная вероятность замены на неправильное основание. Следовательно, некая мутация может возникнуть с равной вероятностью в любой генерации фага и все копии, образующиеся после этого события, будут мутантами. Результаты этого опыта показали, что цепи ДНК исходных частиц фага Т4 неоднократно копировались внутри одной зараженной бактериальной клетки.
Модификации, вызываемые хозяином
В дополнение к мутациям бактериофаги подвергаются негенетическим изменениям, в которых основная роль принадлежит клетке-хозяину. Это явление получило название модификаций, вызываемых хозяином (Luria, Human, 1952; Arber, 1965, 1974). Важность этих модификаций для молекулярной биологии состоит в том, что они продемонстрировали способность внутриклеточной среды вызывать такие изменения в химическом строении генетического материала, с помощью которых можно идентифицировать клеточные линии, синтезирующие ДНК. Подобные явления были впервые открыты на фаговой ДНК, однако они верны и для любой ДНК бактериальной клетки. Есть также наблюдения, согласно которым этот феномен справедлив и для эукариотических клеток. В особых случаях могут возникнуть более сложные ситуации. Двустороннее ограничение фага двумя хозяевами иногда наблюдается, но оно не является обязательным.
Фаг, который отвергается клетками, способен адсорбироваться на них и инъецировать свою ДНК. Однако часть последней быстро разрушается и репликации не происходит. Деградация ДНК обусловлена специфическими эндонуклеазами (рестриктазы, или R-нуклеазы), которые способны узнавать особые участки ДНК и расщеплять их, если они не были модифицированы под влиянием М-ферментов. После этого происходит расщепление ДНК экзонуклеазами до отдельных нуклеотидов. Бактериальный штамм может иметь одну или несколько R-нуклеаз и одновременно М-ферменты, которые предохраняют собственную ДНК клетки. Предложена удобная номенклатура этих ферментов. Согласно ряду данных, участки узнавания R-нуклеаз не всегда совпадают с участками расщепления ДНК; возможно, фермент способен мигрировать вдоль цепи, прежде чем он найдет участок, где ДНК подвергнется расщеплению. Модификации обычно заключаются в метилировании аденина или цитозина в специфических участках ДНК. Донором метильных групп при этом служит S-аденозилметионин. Участки, которые способны распознаваться R- и М-ферментами, часто являются палиндромами:
5…pGpTpPupPypApCp…3
3…pCpApPypPupTpGp…5
где Pu и Py обозначают соответственно пурины и пиримидины. Метилирования даже одной цепи вполне достаточно для защиты последовательностей от действия рестриктазы. М- и R-активности входят в состав ферментного комплекса, построенного из нескольких субъединиц. Последние кодируются системой из трех генов. Одна из субъединиц ответственна за распознавание нуклеотидной последовательности.
Функциональная роль модификаций, вызываемых хозяином, неясна. Они способны защитить данный штамм бактерий от массивного разрушения фагами, растущими на различных бактериях. В более общем виде роль модификаций можно определить как защиту от попадания неприемлемой чужеродной ДНК в бактериальную клетку и последующего ее «приживления». Бактерия А, которая отвергает фаг, размножающийся на штамме В, отвергает также и ДНК бактерии В, если ее вводить с помощью конъюгации или трансдукции.
Изменчивость вирусов при пассажах
Изменчивость вирусов при пассажах на животных.
Основоположником этого метода изменения наследственности вирусов был Пастер (1882 год), впервые получивший живую антирабическую вакцину путем серийных пассажей через мозг кролика дикого (вирулентного) штамма вируса бешенства. Было продемонстрировано, что изменчивость вирулентности вируса в процессе пассажей происходит не сразу, а поэтапно, путем последовательных наследственных изменений. Так, при внутримозговом заражении кролика культурой вируса десятого пассажа инкубационный период колебался от 10 до 14 дней, после 21 пассажа он сократился до 7 – 8 дней, а штамм, выделенный после 90-го пассажа, обладал строго фиксированным инкубационным периодом (6 – 7 дней) для кролика и был авирулентным для человека. Селекционированный аттенуированный вариант был использован для иммунизации людей против бешенства. Аттенуированный штамм при подкожном введении утратил патогенность для собак и кроликов, не проникал в слюнные железы, более активно размножался в мозгу кролика, вызывая при этом менее выраженные патоморфологические изменения в ЦНС; как исключение вызывал образование телец Бабеш – Негри и, наконец, быстро инактивировался глицерином. Этими эследованиями был открыт один из методов экспериментального получения живых вакцин против вирусных болезней.
В ряде исследований показана изменчивость отдельных свойств вируса осповакцины при пассажах на животных (кроликах, телятах и других животных). Успешные опыты были проведены с вирусом желтой лихорадки, показавшие возможность значительного усиления нейровирулентности для мышей при пассажах через мозг, с одновременной утратой вирулентности для обезьян при подкожном и внутрибрюшинном введении. В процессе чередующихся подкожных и внутрибрюшинных пассажей был селекционирован авирулентный вариант для мышей, сохранивший иммуногенные свойства. После 260 пассажей селекционированный мутаген использовали для приготовления живой вакцины.