Реферат: Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності

5. Визначити інтенсивність окисно-відновних та синтетичних процесів у ембріонах корів при інкубації у поживних середовищах.

Об’єкт дослідження: фізіолого-біохімічні процеси в еякулятах і сперміях бугаїв, фолікулах яєчників, ооцитах та ембріонах корів.

Предмет досліджень : сперма бугаїв свіжоотримана і розморожена, спермії, яєчники, клітини гранульозного шару фолікулів, ооцити та ембріони корів.

Методи дослідження : фізіологічні, біохімічні, цитоморфологічні, біотехнологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено роль окисно-відновних процесів у забезпеченні високих значень фізіологічних показників і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг і регуляцію окисно-відновних процесів при капацитації сперміїв та дозріванні ооцитів і, після їх запліднення, росту ембріонів. Встановлено фактори оптимальної рівноваги між процесами окиснення і відновлення у статевих клітинах та маркери їх інтенсивності. Вперше в спермі бугаїв установлено оптимальні рівні інтенсивності окисно-відновних процесів, межі яких забезпечують високі фізіологічні показники і запліднюючу здатність сперміїв у свіжоотриманих і розморожених еякулятах. Вивчено вплив аскорбінової кислоти і відновленої форми глутатіону на енергетичний та міжклітинний обмін, значення для фізіологічного стану сперміїв, характеристики напруженості окисних процесів та ефективність впливу антиоксидантів у розріджувачі сперми на запліднюючу здатність. Доведено вплив окиснення субстратів розріджувача та середовищ культивування на фізіологічний стан сперміїв і клітин гранульози, дозрівання ОКК, запліднення і розвиток ембріонів in vitro. Встановлено зв’язок капацитації сперміїв бугаїв з придатка сім’яника зі споживанням кисню, відновною здатністю, активністю сукцинатдегідрогенази (СДГ) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ), вмістом білків, морфологічними змінами в акросомі. Вивчено в яєчниках у зв’язку з їх фізіологічним станом динаміку антиоксидантів, білкових фракцій і глікопротеїнів, вплив на інтенсивність фолікуло- та оогенезу, якість ооцитів і придатність для використання в репродуктивній біотехнології; інтенсивність процесів окиснення і відновлення в ембріонах у зв’язку зі стадіями розвитку.

Практичне значення отриманих результатів. Удосконалені способи оцінювання якості еякулятів бугаїв („Спосіб визначення кількості живих сперміїв у еякулятах бугаїв”), підвищення стійкості сперміїв до факторів зовнішнього впливу („Спосіб захисту сперміїв бугаїв при заморожуванні”), оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за активністю ферментів дихального ланцюга („Спосіб визначення сукцинатдегідрогенази в спермі бугаїв”). Способи оцінювання якості сперміїв бугаїв включені у довідник „Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині” (2004). Розроблено середовище, що забезпечує високу ефективність вирощування ембріонів корів поза організмом („Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій in vitro”). Матеріали дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій ”Способи оцінювання якості еякулятів бугаїв та підвищення запліднювальної здатності сперміїв”, СОУ 1.42-37-6171: 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”.

Способи використані племпідприємствами для визначення якості та запліднюючої здатності сперми бугаїв, акапацитації сперміїв йвисокоефективне середовище вирощування ембріонів іn vitro–для наукових досліджень та практичних робіт з отримання ембріонів великої рогатої худоби поза організмом.

Основні положення дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Сумського національного аграрного університету,

Харківської державної зооветеринарної академії Міністерства аграрної політики України, Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено науково-дослідну програму, проведено експериментальні дослідження, аналіз першоджерел літератури, розроблено теоретичне обґрунтування з відбору та оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, механізмів капацитації сперміїв, оогенезу та ембріогенезу в корів, зроблені фотографії сперміїв, ооцитів і ембріонів, відзняті процеси капацитації сперміїв, запліднення і розвитку ембріонів корів. Проведено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему й методичні підходи проведення досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і результатів досліджень апробовані і схвалені на міжнародних та республіканських науково-практичних конференціях і з’їздах: “Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченої 35-річчю Інституту фізіології і біохімії тварин та 95 -річчю від дня народження засновника інституту, академіка УА СГН, заслуженого діяча науки України, професора Ґжицького С. З.” (Львів, 1995), “Актуальні проблеми розвитку сучасної зооветеринарної науки”, (Львів, 2001), “Здобутки і перспективи ветеринарного акушерства” (Львів, 2002), “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, 2003), “Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2006), “Тваринництво XXI сторіччя: новітні технології, досягнення та перспективи” (Харків, 2006), “Механізми функціонування фізіологічних систем (Львів, 2006), “Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку” (Харків, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 наукових праць, з яких 30 статей, СОУ 1.42-37-6171 : 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”, методичні рекомендації, 9 публікацій у матеріалах конференцій та отримано 4 патенти на винахід.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, висновків і практичних пропозицій, додатків, списку джерел літератури, який включає 867 назв, з них 756 іноземних. Текст викладений на 359 сторінках комп’ютерного варіанту, включає 17 рисунків і 72 таблиці.

Умовні позначення: СС – суспензія сперміїв; СМ – слизова матки корови; СК – суспензія клітин; БСА – альбумін сироватки крові бугая; ФР – фолікулярна рідина; ГП – гепарин; АМП – амідопірин; т-БГП – т-бутилгідроперекис; МДА – малоновий діальдигід; Г-SH – відновлена форма глутатіону; АА – аскорбінова кислота; ММ – молекулярна маса.

Основний зміст роботи

Огляд літератури складається з 5 розділів у яких наведені дані з характеристики фізіологічних показників та інтенсивності окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв та фолікулах яєчників корів, сперміях і ооцитах при підготовці і використанні їх у штучному осіменінні та репродуктивній біотехнології, впливу природних антиоксидантів та умов культивування на запліднюючу здатність сперміїв, запліднення ооцитів і розвиток ембріонів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконано протягом 1994–2005 років в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН, Львівському, Сокальському, Судово-Вишнянському, Дрогобицькому племпідприємствах, м’ясопереробних підприємствах: „Прикарпаття” та „Галев-Ресурс”.

Досліджували, отриману на штучну вагіну, сперму 72 бугаїв у віці 2–9 років (порід: української чорно-рябої молочної, німецької, голландської, голштинської чорно-рябої, британо-фризької) систематично з інтервалом 10–14 днів. Визначали у свіжоотриманих еякулятах – об’єм (мл), рухливість сперміїв (активність, бали), концентрацію (10⁹ клітин/мл) та кількість живих (%; Яблонський В. А., 1962), виживання при температурі + 46,5°С (хв; Рослановський П., 1962) після розбавлення 1 : 10 розріджувачем для заморожування сперми в облицьованих гранулах; резистентність (тис; Смирнов І. В. , 1976); у розмороженій спермі – виживання сперміїв (хв) при температурі +38,0°С. Спермії з придатка сім’яника отримували після забою бугаїв у віці 10–8 міс через надріз стінки каналу придатка з наступним вимиванням 2,8%-ним розчином натрію цитрату чи 0,9%-ним натрію хлориду. У суспензії сперміїв (СС) визначали концентрацію (10⁹ клітин/мл) підрахунком у камері Горяєва, рухливість – візуально, під мікроскопом, активність СДГ (мкМ/хв/л; Чухрій Б. М. та ін., 1995), цитохромоксидази (ЦХО; мкМ/хв/л; Чухрій Б. М., Клевець Л.О., 1978); вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення (дегідроаскорбінову і дикетогулонову кислоти; мкг/мл; Климов А. М., 1956), дихальну активність – полярографічно (нг-атом О/0,1мл СС/хв); відновну здатність – потенціометрично (фериціанід калію – 10^-4 М; мкг перетвореного К₃ [Fe(СN)₆ ] (мкг К₃ ...)/0,1мл СС/хв; Штольц К.Ф. та ін., 1980). Інтенсивність дихання та відновну здатність сперміїв досліджували при температурі +38,5°C у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ; NaCl–0,8г, KCl–0,02г, Na₂ HPO₄ –0,11г, KH₂ PO₄ –0,02г, MgCl₂ –0,01г, Н₂ О до 100 мл). Для вивчення окисно – відновних процесів у статевих клітинах бугаїв та впливу чинників капацитації отриману з придатка сім’яника СС, оцінених за рухливістю, зберігали 6–8 год при температурі 0 – +4°С з наступним інкубуванням 30, 60 і 120 хв (температура +38,5°С) у середовищах капацитації: контрольному – ФСБ та дослідних – ФСБ з додаванням: гомогенату слизової матки корови (СМ; яєчник зі ”свіжою овуляцією” – на місці фолікула утворився згусток крові); фолікулярної рідини (ФР; не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см, 20% концентрація у пробі); гепарину (ГП, 200 од/мл); 0,1% розчину БСА зі 150 мМ натрію хлориду; амідопірину (АМП, 4Ч10^-3 М); перекису водню (Н₂ О₂ ; 1%-ний розчин). Досліджували: стан акросоми сперміїв (GrossN.L., MeizelS., 1989), інтенсивність поглинання кисню та відновну активність без- та за наявності інгібіторів. Використані інгібітори: гліколізу – натрій фторид (NaF; 10^–3 M); ланцюга дихання мітохондрій: НАД-залежної ланки – амітал (АМ; 5Ч10^-3 М) і термінальної (цитохромоксидази) – натрію азид (NаN₃ ; 5Ч10^–2 M). Вільнорадикальне окиснення ненасичених жирних кислот, яке супроводжується споживанням кисню, інгібували NаЕДТА (6Ч10^-4 М; Орехович В.Н., 1977). При цьому, різницю між споживанням кисню чи відновною активністю до- та після додавання інгібітора вважали часткою біохімічного процесу, відповідно, у реалізації кисню та постачанні відновних еквівалентів у позаклітинний простір. Енергетичні потреби сперміїв забезпечували фруктозою (20мМ), піруватом, сукцинатом, глутаматом, a-кетоглутаратом (б–КГ), малатом (по 10^-2 М). Активність Г-6-ФДГ ( мкМ НАДФН /мл/хв; Farnararo M. etal., 1978, GruceanuA., BucsaL., 1979 ) та СДГ визначали за наявності фолікулярної рідини та гепарину, після інкубації 120 хв при +38°С. Спектр білків у процесі виживання сперміїв (при температурі +46,5°С) і після зберігання (при температурі 0 – +4°С) вивчали електрофорезом у поліакриламідному гелі (ПААГ; 7,5% та 12,5% з 0,1%-ним вмістом натрію додецилсульфату) у еякулятах та СС. Ідентифікували окремі білки за допомогою відповідних маркерів з молекулярними масами (ММ): 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа (LMW; Pharmacia, Швеція).

Вплив антиоксидантів на окисно-відновні процеси в еякулятах, вивчали у ФСБ при додаванні глутатіону (відновлена форма, Г-SH; 3Ч10^-3 М) і аскорбінової кислоти (АА; 5Ч10^-3 М) та моделюванні ”окисного навантаження” (т- бутилгідроперекис; т-БГП, 10^-3 М) за наявності субстратів: фруктози, пірувату, б-КГ, сукцинату і лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача сперми (ЛЖГ-cредовище) на дихальну та відновну активності сперміїв без- та з використанням інгібіторів. Вплив Г-SH і АА вивчали в еякуляті розділеному на частини – контрольну (ЛЖГ- cередовище) і дослідні – ЛЖГ-cередовище з додаванням: АА (2,50; 5,0; 10,0 мМ); Г-SH (2,50; 5,0; 10,0 мМ) та поєднання АА+Г-SH (1,25+1,25; 1,25+2,5; 2,50+2,50; 5,0+5,0 та 10,0+10,0 мМ). Досліджували у свіжоотриманій і розмороженій спермі інтенсивність поглинання кисню і відновну здатність, активність СДГ і ЦХО, вміст малонового діальдигіду (МДА; TappelA. L., ZalkinH., 1959), рухливість, виживання і резистентність статевих клітин. Для штучного осіменіння корів використовували сперму бугаїв Контакта 1375 і Ринка 2919. Кожен еякулят розділяли на дві частини, контрольну (без антиоксидантів) і дослідну (з антиоксидантами). Ефективність доданих антиоксидантів у розріджувачі визначали обліком результатів штучного осіменіння корів-аналогів.

Відбір яєчників корів за ооцитпродуктивністю, вивчення окисних процесів у фолікулах та ооцитах проводили після оцінювання їх фізіологічного стану: “фолікулярного зростання”, без жовтого тіла; зі ”свіжою” овуляцією, на місці фолікула утворена порожнина, жовте тіло відсутнє або діаметром до 0,5см, червоного кольору; з “раннім” жовтим тілом, діаметром 1,0–2,0см, червоного або брунатного кольору; з “пізнім” жовтим тілом, діаметром 0,5–1,5см, жовтого кольору. Для досліджень використовували яєчники корів з фолікулами діаметром до 4мм (малі), 4–7мм (середні) і більше 7мм (великі).

Антральну рідину (фолікулярна рідина + клітини гранульозного шару фолікулів + ооцити), отримували методом аспірації фолікулів. У ній визначали кількість клітин гранульозного шару – підрахунком в камері Горяєва (10⁶ клітин/мл) та ооцитів – оцінювали стан кумулюсу (без кумулюсу – “голі”; з розпушеним або частково втраченим; з компактним багатошаровим) і поміщали в чашки Петрі з середовищем культивування. В антральній рідині фолікулів вивчали активність Г-6-ФДГ, вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення її і глутатіону (мг%; Чулкова М. С., 1955). Для вивчення локалізації антиоксидантів антральну рідину ділили на частини – в одній визначали їх вміст, іншу центрифугували при 600 g 15 хв, супернатант відділяли, а осад суспендували в адекватному об’ємі 0,9 %-ного натрію хлориду. Процедуру повторювали двічі. Антиоксиданти визначали у супернатанті (фолікулярній рідині) та суспендованому осаді (клітинах гранульозного шару фолікулів). Крім цього, у фолікулярній рідині вивчали вміст загального білка (г%) біуретовою реакцією, фракції білків елекрофорезом в 7,5% ПААГ (%) та глікопротеїнів (%; реактивом Шиффа). Клітини гранульозного шару фолікулів суспендували в середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories) і вивчали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/0,1мл суспензії клітин (СК)/хв); відновну активність (мкг К₃ …/мл СК/хв) без- та з інгібіторами. НАДН-редуктазні процеси стимулювали НАДН (10^-3 М), вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4 М).

Для дозрівання ооцити інкубували в чашках Петрі з середовищами культивування клітин: ТС 199, Іґла (Sigma), RPMI-1640. До середовищ додавали: 10% фолікулярної рідини (не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см), 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки крові корів, клітини гранульози (5–7Ч10⁶ /мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Ооцити культивували в герметично закритому ексикаторі 16–18 год за максимальної вологості, вмісту СО₂ 5,0% і температури 38,5°С, рН середовища 7,2–7,4.

Запліднювали ооцити in vitro сперміями з придатка сім’яника, після капацитації у фолікулярній рідині (0,1мл СС; 12,0–15,0Ч10⁶ /мл з активним прямолінійним рухом), які вносили в чашки Петрі до ооцитів проінкубованих 16–18 год.

Для вивчення інтенсивності окисних процесів у ембріонах, після 16–18 год спільного культивування ооцитів зі сперміями, ембріони переносили в середовища культивування: ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які додатково містили 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогів матки корів. Культивували в герметично закритому ексикаторі при максимальній вологості, температурі 38,5°С, 5% СО₂ . Середовище замінювали через кожні 48 год культивування.

У свіжоотриманих і збережених (24 год) ооцитах, визначали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/ооцит/хв) та відновну активність (пкг К₃ .../ооцит/хв) при використанні субстратів – ендогенних (ФСБ Дюльбеко) і екзогенних: сукцинату (10^-2 М), АТФ (5Ч10^-6 М), середовищ культивування клітин (ТС 199, Іґла, RPMI-1640). Для виявлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню за наявності ендо- та екзогенних субстратів використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10^-3 М); НАДН-залежної ділянки дихального ланцюга (амітал; 5Ч10^-3 М); термінальної (NaN₃ ; 5Ч10^-2 М); вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4 М).

У ембріонів різних стадій розвитку визначали дихальну і відновну активність у середовищах – ФСБ Дюльбеко і RPMI-1640. Для встановлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10^-3 М); НАДН-залежної (амітал; 5Ч10^-3 М) та термінальної (натрію азид; 5Ч10^-2 М) ділянок дихального ланцюга, вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10^-4 М).

Матеріал документували мікрофотографіями.Статистичний аналіз отриманих результатів проведено за Плохінським М. О. (1969) з використанням комп’ютера та розроблених програм (програмне забезпечення Clipper).

Результати Власних досліджень та їх аналіз