Реферат: Опиоидергические механизмы тревожных расстройств

4. Анксиолитическое действие селанка и даларгина на животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений, в том числе, расстройств функций сердечно-сосудистой и иммунной систем.

Материалы и методы

Характеристика клинического материала. В работе всего изучено 225 человек. Из них 74 здоровых добровольца (39 женщин, 35 мужчин, средний возраст 30±2 года), 59 пациентов (29 женщин, 30 мужчин, средний возраст 31±2 года), у которых, в соответствии с критериями DSM‑4, диагносцировались тревожно-фобические расстройства (генерализованное тревожное расстройство, паническое расстройство или агорафобия)[1] . В рамках второй фазы клинических испытаний селанка было обследовано 30 больных, в состоянии которых имелись проявления тревоги. По МКБ‑10 у них было диагностировано ГТР (12 человек), смешанное тревожно-депрессивное расстройство и депрессивный эпизод (по 9 человек)[2] . В клинико-биологическое исследование, проводившееся в рамках третьей фазы клинических испытаний селанка в сравнении с медазепамом, были включены 62 пациента (13 мужч., 49 женщ., средний возраст 38,6±9,1 лет): 30 с генерализованным тревожным расстройством (F41.1) и 32 с неврастенией (F48.0). Продолжительность заболевания у всех пациентов равнялась 14,0±17,9 месяцев, у пациентов, страдающих ГТР и неврастенией – 12,0±10,0 и 15,9±23,0, соответственно[3] . Препарат селанк использовался в виде 0,15% раствора для интраназального применения, его суточная доза (2.7 мг) была разделена на 3 приема. Медазепам использовался в таблетированной лекарственной форме в суточной дозе 30 мг, разделенной на 3 приема.

Критериями, исключающими участие в исследовании как здоровых доноров, так обследованных больных, являлись: возраст старше 50 и моложе 18 лет, наличие в анамнезе острых и хронических заболеваний печени и почек, а также применение гипотензивных препаратов, фармакологическое действие которых основано на ингибировании ангиотензинпревращающего фермента (капотен, энап и т.п.).

Для оценки состояния пациентов использовались следующие методики: шкала оценки выраженности симптоматики,составленная на основе «Унифицированной системы оценки клинико-фармакологического действия психотропных препаратов у больных с пограничными нервно-психическими расстройствами» (Александровский и соавт., 1984), шкала для объективной оценки тревоги Гамильтона (HAMA) (Hamilton, 1959), шкала самооценки тревоги Цунга (ASRS, Zung, 1971), шкала общего клинического впечатления (CGI) (NationalInstituteofMentalHealth, 1976). Степень дисфункции вегетативной нервной системы оценивали по методу А.М. Вейна (1998 г.). Сила и интенсивность панических атак оценивалась по шкале панических атак и приступов тревоги Шихана (Sheehan, Sheehan, 1983).

Психологическое тестирование. Оценку конституционально-личностных характеристик пациентов проводили при помощи Личностного опросника Айзенка (EysenckPersonalityInventory, или EPI) в адаптации И.Н. Гильяшевой (1983), предназначенного для диагностики двух базовых измерений личности: невротизм – эмоциональная стабильность и экстраверсия-интроверсия. Сочетание оценок по этим шкалам позволяет разделить испытуемых на 4 типа темперамента: меланхоликов, холериков, сангвиников и флегматиков. Граничное условие – 12 баллов по обеим шкалам.

Уровень личностной тревожности пациентов определяли по шкале Спилбергера в адаптации Ю. Ханина (1976).

Используемые животные. В эксперименте использовали 574 белых беспородных крысы (517 самцов и 57 самок), 123 крысы-самца популяции Wistar, полученных из питомника РАМН «Столбовая», а также 270 мышей-самцов линии Balb/с, 68 мышей-самцов линии C57Black/6 и 10 белых беспородных крыс-самцов, полученных из питомника «Крюково-Центральное». Животных содержали в стандартных условиях вивария по 10 в клетке МАKIV при температуре 22⁰ С, световом режиме 12:12 часов (свет с 8.00 до 20.00), питьевом и пищевом режиме ad libitum. В течение 3 недель до начала эксперимента животные адаптировались к условиям вивария.

Тестирование спонтанной двигательной активности животных. Тестирование спонтанной двигательной активности крыс проводили в течение пяти минут в компьютеризированной системе Auto Track System (ATS) фирмы Columbus Instruments (США), представляющей собой «мягкий вариант» системы «открытое поле»: слабое освещение и размеры камеры (42х42х20 см) близки к обычным условиям содержания животных. Тестирование проводили в соответствии с методикой, разработанной под руководством проф. Г.Г. Барсегяна (Кордзадзе и соавт. 1992).

При проведении всех фармакологических исследований животных разбивали на экспериментальные группы, гомогенные по параметру «горизонтальная двигательная активность в ATS» (ГДА). При статистическом анализе полученных данных, в зависимости от величины выборки экспериментальных животных, было использовано два критерия ранжирования крыс по ГДА. В случае относительно маленьких выборок использованных в эксперименте животных, исходя из значений медианы ГДА, выделялось две группы: высоко- и низкоактивных. При достаточно больших выборках животных разбивали на три группы по методу, описанному Р.Н. Кордзадзе и соавторами (1992). Критериями отбора служили точки перегиба на кривой нормального распределения, описывающей ГДА данной выборки крыс. Крысы, значения ГДА которых располагались на кривой до первой точки перегиба, считались «низкоактивными», после второй точки перегиба – «высокоактивными», а животные с двигательной активностью, укладывающейся в среднюю часть кривой – «средними».

Тестирование двигательной активности большой выборки (около 2000) животных, проведенное в НЦ ПЗ РАМН в нашей лаборатории и в лаборатории проф. Г.Г. Барсегяна за несколько лет, показало, что для крыс популяции Wistar, полученных из питомника Столбовая, точки перегиба на кривой нормального распределения соответствовали ГДА около 1100 и 1600, а для белых беспородных крыс из питомника Крюково – 1086 и 1860 см/5 мин.

Спонтанную двигательную активность мышей оценивали в течение 5 мин в аналогичной ATSавтоматизированной системе Rat-o-Matic(Columbus Instruments, США), регистрирующей горизонтальное перемещение (аналог ГДА), количество стоек и встряхиваний животного.

Обучение и тестирование крыс в «челночной камере». Обучение крыс в «челночной камере» проводили с использованием экспериментальной компьютеризированной установки «Reflex‑16» фирмы «Columbus Instr» (США) по схеме, описанной в статье А.А. Зозуля и соавт. (1996). К избравшим активную стратегию избегания относились животные, преимущественно (>70% предъявлений) реагировавшие на условный сигнал, животные с пассивной стратегией реагировали на электрошок или у них наблюдалось отсутствие перехода (>70% предъявлений).

В эксперименте по изучению влияния даларгина на иммунный статус и поведение крыс в «челночной камере» через день после окончания обучения животным проводили пятидневный курс введения даларгина. Даларгин вводили внутрибрюшинно по 20 мкг/кг один раз в день. Контрольным животным в том же объеме вводили физиологический раствор. На следующий день после последнего укола крыс тестировали в «челночных камерах» и через 2 часа после тестирования забивали.

Конфликтный тест Вогеля проводился в анксиометре фирмы «Columbus Instr» (США), как описано в статье А.А. Зозуля и соавт. (1999).

Тест «открытое поле» (ОП) проводили по стандартной методике (Середенин С.Б. и соавт., 1998).

Тестирование животных в установке «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) проводили по стандартной методике в течение 5 мин. Установка для тестирования крыс была приподнята на высоту 50 см и состояла из двух открытых (45х10 см), двух закрытых рукавов (45х10х40 см) с открытой крышей и центрального квадрата (в месте соединения) со стороной 10 см. Мышей тестировали в подобной установке с размерами рукавов 23х4.5 см и высотой стенок закрытого рукава 17.5 см.

При изучении анксиолитических эффектов опиоидных пептидов на крыс на следующий день после тестирования в АТS часть животных лишали питья при пищевом режиме adlibitum. Одновременно начинали курс введения (5 дней, 1 раз в день) даларгина или ДАГО (20 мкг/кг внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора), крысам контрольной группы – физиологический раствор. Налоксон (10 мг/кг внутрибрюшинно) в соответствующем эксперименте вводили одновременно с даларгином. При исследовании центрального эффекта даларгина за день до инъекции крысам под легким эфирным наркозом и новокаиновой блокадой сверлили отверстие в крыше черепа и на сутки помещали в одиночные клетки при питьевом и пищевом режиме adlibitum. Препарат вводили однократно в четвертый желудочек мозга в дозах 0,05; 1,00 и 20,00 мкг/кг в 5 мкл. BNTX и налтрибен (0.5 и 10 мкг/кг) вводили одновременно с даларгином (0.05 мкг/кг).

Тестирование влияния селанка на поведение мышей Balb/c в ПКЛ проводили без дополнительных стрессорных воздействий через 30 минут после внутрибрюшинного введения в объеме 0.2 мл физиологического раствора, селанка (600 мкг/кг), налоксона (10 мг/кг) и смеси селанка с налоксоном в тех же дозах.

Определение частоты сердечных сокращений (ЧСС). Для измерения ЧСС животным подкожно вводили микроэлектроды в районе ушей, помещали в стандартную клетку при стандартном освещении и подключали к полиграфу «Мингограф‑7» (ФРГ). ЧСС определяли по количеству R-R интервалов за 10 сек с периодичностью в 30 секунд в течение 5 минут.

Пролиферативную активность лимфоцитов крови крыс определяли по включению Н-тимидина в ДНК культивируемых клеток. Для этого кровь разводили в 10 раз средой 199, содержащей 10 мМ ХЕПЕС и 50 мкг/мл гентамицина, 100 мкл разведенной крови смешивали со 100 мкл обогащенной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамин неспецифический Т-клеточный митоген КонА (в диапазоне концентраций от 0 до 25 мкг/мл). Культивирование проводили при 37^о С в течение 96 часов. За 20 часов до окончания инкубации в пробы добавляли по 2 мкКи Н-тимидина. Разделение включенного в ДНК и свободного ³ Н-тимидина проводили фильтрацией на стекловолокнистых фильтрах GF/C с помощью клеточного харвестера. Радиоактивность определяли на счетчике MiniBeta.

Мембранную фракцию головного мозга крыс , используемую в радиорецепторном анализе (РРА), получали модифицированным методом Simantovetal. (1976). Для получения Р2 мембранной фракции, использованной при определении активности мембраносвязанных энкефалиндеградирующих ферментов, мозг животных гомогенизировали в охлажденном 50мМ Трис-НСI буфере рН 7,7, содержащем 20% сахарозы, (соотношение вес/объем =1/20) в гомогенизаторе Potter (стекло / тефлон). Гомогенат центрифугировали при 1000 g 20 мин, 4^о С. Полученный супернатант повторно центрифугировали (30000g, 30 минут, 4^о С), осадок ресуспендировали в том же объеме 50мМ Трис-НСI буфера рН 7,7 и снова осаждали (30000g, 30 минут, 4^о С).

Вытесняющую активность лигандов ОР определяли в плазме крови и гиппокампе крыс. При взятии крови качестве антикоагулянта использовали 3% раствор Na₂ ЭДТА (в соотношении 1:10) с добавлением бацитрацин (200 мкг/мл крови). Кровь центрифугировали при 1000g 10 мин, 4⁰ С. Плазму замораживали и хранили при -40⁰ С. Гиппокампы выделяли на холоду, замораживали в жидком азоте и хранили при -40⁰ С.

Экстракцию опиоидов проводили 0,25 М уксусной кислотой (15 мин., 100⁰ С, 1:10). Раствор замораживали, пробы лиофилизировали и хранили при -40⁰ С. Непосредственно перед тестированием образцы растворяли в 50 мМ трис-НСl буфере (рН 7.7), центрифугировали при 8000g 15 мин., в супернатантах определяли вытесняющую активность лигандов ОР мю- и дельта-типов радиорецепторным методом.

Радиорецепторный анализ проводили, как описано ранее (Зозуля А.А. и соавт., 1994).Инкубационная смесь объемом 300 мкл содержала 50мМ Трис-HCI буфер рH 7,7 (20^о C)³ Н-ДАДЛЭ (0,5–4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 42 Ки/ммоль) или ³ Н-ДАГО (4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 40 Ки/ммоль), 1,0–1,5 мг/мл белка мембран головного мозга крыс, 50 мкг/мл ингибитора протеаз бацитрацина. Величину специфического связывания определяли по разности связывания меченого лиганда в отсутствии и присутствии избытка (2мкМ) соответствующих холодных лигандов. Она составляла в 65–85% от общей величины связывания. В случае определения вытесняющей активности эндогенных опиоидов в плазме крови и гиппокампе крыс в инкубационную среду добавляли экстракты этих тканей в трех разведениях, а параллельно строили калибровочные кривые вытеснения ³ Н-ДАДЛЭ (4,0 нМ) и ³ Н-ДАГО соответствующими холодными лигандами и лей-энкефалином. Активность эндогенных опиоидов в экстрактах оценивали сопоставлением полученных результатов с калибровочной кривой и выражали в моль-эквивалентах.

Равновесные константы связывания (константа диссоциации (Кд) и максимальное число мест связывания (Вмах)) Н-ДАДЛЭ с ОР обонятельных луковиц и стриатума крыс определяли путем линеаризации кривых насыщения в координатах Скэтчарда.

Определение активности энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) проводилось invitroв плазме и сыворотке крови животных и человека и в мозге животных. В этих тканях гидролиз энкефалина происходит по всем пептидным связям и катализируется целым рядом ферментов. Для оценки суммарной активности ЭДФ в тканях определяли: при насыщающих концентрации субстрата максимальную скорость реакции (Vmax, по кривой Михаэлиса-Ментен), являющуюся суммой активностей всех ЭДФ, и при малых концентрациях субстрата – время полупревращения энкефалина (τ_1/2 ), отражающее реальную скорость гидролиза этого пептида в биологических объектах.

При определении τ_1/2 лей-энкефалина инкубационная смесь (конечный объем 50 мкл) содержала 10‑кратно разведенную плазму или сыворотку крови, 25 мМ трис-HCl (pH=7,5), 0,15М NaCl, 1 мкКи (150 нМ) равномерно меченного тритием [G³ Н] – лей-энкефалина с удельной активностью 120 Ки/моль. Инкубацию проводили при температуре 37°С и останавливали добавлением 5 мкл 0,2 М НСl. Vmax определяли при добавлении 1.5 мМ холодного лей-энкефалина в инкубационную среду. При определении активности ЭДФ мозга инкубационная смесь содержала Р2‑мембранную фракцию мозга крысы или фракции гомогената мозга мышей в концентрации по белку 0.05 – 3.0 мг/мл. Продукты гидролиза [G³ Н] – лей-энкефалина разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в двух системах: этилацетат: изопропанол:вода: уксусная кислота 40:40:1:19 (для силикагельных пластинок Merck, Германия и SILICAGEL 6061, EASTMAN, KodakCompany, США) и 2‑бутанон: трет-бутанол: аммиак:вода 2:2,4:1:1 (для Silufol, Чехия).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза [ G ³ Н] – лей-энкефалина и [ G ³ Н] – селанка. Для более четкого разделения всех возможных фрагментов [G³ Н] – лей-энкефалина, образующихся в результате его ферментативного гидролиза, а также для анализа путей биодеградации селанка была использована ВЭЖХ по методу (Золотарев и соавт., 2006). Экстракцию пептидных фрагментов из биологических образцов проводили 4‑х кратным объемом ацетонитрила с дальнейшим переводом экстракта в 0.1% водный раствор трифторуксусной кислоты.