Реферат: Получение антисывороток и поликлональных антител
6. Отмывка от несвязавшегося антигена
1 г высушенного препарата дает около 4,5 мл геля
Использовать для промывки раствор 1 мМ HCl, а затем для уравновешивания и набухания - боратный или гидрокарбонатный буфер
Использовать гидрокарбонатный или обратный буфер
Гидрокарбонатный буфер: 0,1 MNaHCO3 , содержащий 0,5 NaCl
Раствор должен содержать 5-10 мг антигена
Два часа при комнатной температуре или ночь при +4 °С
Гель промывается буфером, содержащим блокирующие соединения. Используются IM этаиоламин или 0,2 M глицин, рН 8,0
Используется буфер, в котором осуществлялось ковалентное связывание, затем 0,1 M ацетатный буфер, рН 4, содержащий 0,5 MNaCl, после, чего гель опять уравновешивается боратным или гидрокарбонатным буфером
Получение Fab-фрагментов.
1. Готовят раствор, содержащий 0,1-3 мг Р2 -фрагмента в 0,45 мл 0,1 MNa-фосфатиом буфере, рН 6,0. ·
2. Добавляют 0,05 мл 0,1 M 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мЛ\ ЭДТА.
3. Смесь инкубируют при 37 0 C в течение 1,5 ч.
4. Тестирование антисывороток.
Антисыворотки, полученные даже от одного животного, значительно различаются по своей способности связывать антиген. Для сравнительной характеристики и оценки качества антисывороток проводят их тестирование, которое позволяет решить следующие две важные задачи: во-первых, произвести отбор именно тех сывороток, которые по своим свойствам удовлетворяют требованиям иммунохимического анализа, во-вторых, осуществить стандартизацию антисывороток при их промышленном производстве для иммуноферментных наборов.
Первичный отбор антисывороток проводят на основании нахождения их титра, который представляет собой интегральный параметр, характеризующий взаимодействие с антигеном. Более детальные сведения о сыворотке получают, определяя аффинность и концентрацию антител. Следующий этап - это установление антигенной специфичности антител, т.е. возможности взаимодействовать со структурно сходными антигенами.
Принципиальное различие этих этапов заключается в следующем: при определении титра исследуют связывание выбранной концентрации антигена при различных разведениях аитисыворотки. При определении аффинности и концентрации антител исследуют связывание антисыворотки с различными концентрациями меченого антигена. При изучении специфичности антисывороток в соответствующем разведении и при постоянной концентрации меченого антигена добавляют различные концентрации перекрестно реагирующего антигена.
Во всех случаях используют концентрации антигена либо близкие к минимально детектируемым в данном виде анализа, либо в том диапазоне, который соответствует их концентрации в Образце.
Определение титра аитисыворотки. Титр - это эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента и от начальной концентрации свободного антигена.
Количественно титр находят как предельное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается положительный регистраруемый данным методом эффект взаимодействия антисыворотки с антигеном. Например, если титр устанавливают методом преципитации свободного антигена в геле и для первой сыворотки образование преципитата наблюдается при разведении в 2т раза, а для другой - в 2" раз, фп титр первой сыворотки равен 2т , а второй - 2", причем вторая антисыворотка менее активная, чем первая. Иногда оперируют понятием "50% -ный титр", подразумевая под этим, соответственно, разведение сыворотки, вызывающее 50% -ное связывание антигена. "Рабочим титром" называют то начальное разведение сыворотки, которое используют непосредственно в эксперименте.
Таблица 5.2. Схема тестирования сывороток
| Этап исследования | Условия | Цель |
|
Титр Аффинность Специфичность |
- постоянна - варьирует постоянна варьирует постоянна - постоянна варьирует |
Отбор высокоактивных иммунных аитисывороток, определение конечного и рабочего титра К-во Просмотров: 234
Бесплатно скачать Реферат: Получение антисывороток и поликлональных антител
|