Вторая особенность прионных болезней обусловлена тем, что они представляют собой неотъемлемую часть теперь уже достаточно обширной (около 40 нозологических форм) группы медленных инфекций человека и животных. Как известно, по­давляющее большинство этих заболеваний вызывают вирусы, известные как возбудители острых инфекций. Это лишний раз подчеркивает справедливость утверждения о том, что большин­ство вирусов в зависимости от условий заражения (или пребы­вания) способствует развитию в организме различных форм ин­фекционного процесса.

В связи с этим прионные болезни занимают особое положе­ние, так как их возбудители не способны к столь выраженной универсальности, как у вирусов, и они (инфекционные прион­ные белки -PrP^Sc ) не формируют и не поддерживают в организ­ме иные процессы, кроме медленного и (как это было установ­лено уже давно и впоследствии неоднократно подтверждалось экспериментально) бессимптомного.

Отмеченная особенность, т.е. неспособность вызывать острую форму инфекционного процесса, по-видимому, обусловлена осо­бенностями самих возбудителей прионных болезней, так как уже давно обнаружено, что сам процесс накопления инфекционного прионного белка PrP^Sc в различных органах и тканях эксперимен­тально зараженного лабораторного животного протекает весьма медленно. Можно полагать, что низкая скорость накопления ин­фекционного агента в данном случае обусловлена событиями, ле­жащими в основе механизма превращения клеточного прионного белка (PrP^C ) в инфекционный прионный белок (PrP^Sc ).

Собственно механизм накопления инфекционного белка в зараженном организме сегодня точно неизвестен. Вместе с тем, исходя из определения, что это посттрансляционный процесс, очевидно, что инфекционный прионный белок вызывает в здо­ровом организме трансформацию нормального прионного бел­ка в инфекционную форму за счет его (нормального белка) конформационных (т.е. пространственных) изменений. В этом случае речь идет об изменении третичной или даже четвертичной структуры исходного белка PrP^C . Таким образом, процесс на­копления инфекционного прионного белка происходит не в ре­зультате синтеза в зараженном организме молекул PrP^Sc denovo, а вследствие конформационных изменений уже синтезирован­ных перед этим нормальных молекул PrP^C под влиянием инфек­ционного прионного белка PrP^Sc (схема). Процесс накопления инфекционного прионного белка обусловлен прежде всего необ­ходимостью контакта двух молекул. В результате под влиянием одной молекулы PrP^Sc происходит трансформация одной моле­кулы PrP^C в ее инфекционную форму PrP^Sc . Следующий этап, как видно на схеме, включает в себя уже наличие влияния двух молекул PrP^Sc , под воздействием которых образуются уже че­тыре молекулы PrP^Sc и т.д. Таким образом, как видно из приведенной схемы, процесс накопления инфекционного прион­ного белка носит лавинообразный характер.

Процесс накопления молекул инфекционного прионного белка

СТРУКТУРА ПРИОННЫХ БЕЛКОВ

Установленные необычные свойства возбудителей ТГЭ по­служили основанием для выдвижения большого количества разнообразных теорий, пытающихся объяснить структуру и хи­мическую природу этих агентов, многие из которых теперь име­ют лишь историческое значение. Резкий скачок вперед в по­нимании природы возбудителей ТГЭ был сделан в результате разработок эффективных методов очистки и концентрации агента скрепи. Существенный вклад в разработку таких методов внесла группа Стенли Прузинера из Калифорнийского универси­тета (США). Разработанная им многоступенчатая система очист­ки позволила получить препараты, очищенные в 100 – 1000 раз. На основании изучения высокоочищенных препаратов авторы пришли к выводу о том, что возбудитель скрепи является белком. Этот вывод был сде­лан в результате анализа инактивации агента при его обработке протеазой К, модификации при воздействии диэтилпирокарбонатом, додецилсульфатом натрия, гуанидинтиоцианатом, фенолом и мочевиной. Агент оставался устойчивым к обработке рядом реа­гентов, инактивирующих нуклеиновые кислоты, что указывало на их отсутствие в его составе. Изучение очищенного препарата возбудителя скрепи показало, что он обладает молекулярной массой около или меньше 50 000 Да.

Следует отметить, что представление о прионной природе возбудителя скрепи, выдвинутое С.Прузинером, оказалось очень плодотворным и послужило основанием для более детального распознавания природы возбудителей ТГЭ. В результате даль­нейшей очистки приона было показано, что его основным ком­понентом является мажорный белок с молекулярной массой 27000 – 30000 Да, обозначаемый как РrР 27–30. Этот белок является составной частью скрепи-ассоциированных фибрилл, при­чем получены структурные и биохимические свидетельства того, что сборка этих фибрилл происходит invivo, и изучены некоторые молекулярные механизмы их образования. По своей физико-химической характеристике РrР представляет собой сиалогликопротеин и является первым идентифицированным структурным компонентом приона скрепи. Появление РrР 27–30 на этапе развития инфекции до раз­вития гистопатологических изменений указывало на то, что этот белок не является вторичным продуктом патологической реакции. Был сделан вывод о том, что РrР 27–30 играет центральную роль в патогенезе скрепи.

При дальнейшем изучении прионов, выделенных из голов­ного мозга зараженных скрепи животных, было выявлено на­личие в ЦНС частиц в виде стержней диаметром 10 – 20 нм и длиной 100 – 200 нм. Ультраструктурно они напоминали ами­лоид и, по-видимому, представляли собой полимерную форму приона скрепи; каждый стержень содержал около 1000 молекул приона. Был проанализирован аминокислотный состав PrP 27–30 и определена последовательность 15 аминокислотных остатков в его полипептидной цепи. В последующем из головного мозга зараженных скрепи хомяков был выделен мажорный белок с мо­лекулярной массой 33–37 кДа, обозначенный как HaSp 33–37; его выделение проводилось без этапа обработки протеазами. Обработка HaSp 33–37 протеазой К приводила к получению продукта, электрофоретически неотличимого от РrР 27–30. Бы­ла определена последовательность 22 аминокислотных остатков HaSp 33–37. Авторы полагали, что HaSp 33–37 представляет со­бой интактную форму белка возбудителя скрепи. Были изучены также некоторые другие характеристики при­онов скрепи и болезни Крейтцфельдта–Якоба. В частности, при изучении липосом было подтверждено предположение о том, что инфекционная частица скрепи содержит 2 молекулы PrP^Sc и по­казано наличие вставок в ген приона при семейных случаях болез­ни Крейтцфельдта–Якоба и синдрома Герстманна–Штреусслера–Шейнкера.

Важным шагом, имеющим как теоретическое, так и методи­ческое значение, было получение антител при использовании в качестве антигенов высокоочищенных прионов скрепи. В сы­воротках кроликов, иммунизированных РrР 27–30, определяли антитела, специфически реагирующие с РrР 27–30 и с несколь­кими белками с более низкой молекулярной массой, очевидно, имеющими общую антигенную детерминанту с РrР 27–30 или являющимися продуктами его расщепления. Полученные анти­сыворотки не взаимодействовали с соответствующими белками, выделенными из головного мозга нормальных незараженных животных. Используя полученную антисыворотку с пероксидазной меткой, удалось показать локализацию прионов в определен­ных отделах головного мозга зараженных животных. В соответ­ствии с ранее полученными данными структуры, связанные с меченой антисывороткой, обладали характеристикой амилоид­ных бляшек. Получение и использо­вание антисыворотки к синтетическому пептиду, соответствую­щему N-концевой части приона скрепи, позволили провести индикацию белка скрепи-ассоциированных фибрилл в головном мозге, селезенке и лимфатических узлах зараженных животных. При этом положительные результаты были получены на ранних этапах инкубационного периода скрепи.

Развитие представлений о прионной природе возбудителя скрепи позволило сделать еще один решающий шаг в познании природы этих необычных агентов. В 1985 г. группе исследова­телей удалось выделить и охарактеризовать ген, кодирующий PrP 27–30. Оказалось, что этот ген содержится в ДНК, выде­ленной из мозга как скрепи-инфицированных, так и нормаль­ных животных; соответственно м РНК для PrP^C была обнаружена в головном мозге и в других тканях как инфицированных скрепи, так и нормальных животных. Используя соответствующую анти­сыворотку, удалось показать, что в тканях незараженных живот­ных содержится белок, антигенно родственный PrP 27–30, но от­личающийся от него чувствительностью к обработке протеазой К. Были получены доказательства того, что PrP^C не кодируется гипотетической нуклеиновой кислотой агента. Эта точка зрения поддерживается в работах R.M.Ridley, H.F.Barker (1997). На основе этих данных были изучены биоге­нез и трансмембранная ориентация клеточной изоформы белка приона скрепи.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРИОНОВ

Физико-химические свойства прионных белков особенно интенсивно изучались в последние годы, в результате чего были сформированы представления и получены новые данные о пер­вичной, вторичной и третичной структуре PrP . Так, при анали­зе первичной структуры PrP^C различных видов животных было выявлено, что 80% последовательностей PrP^C у разных видов жи­вотных были идентичными. Исключение составлял куриный PrP^C , где идентичность последовательностей по отношению к другим видам составляла всего 30%. Тем не менее 24 аминокислотные по­следовательности, располагающиеся между 112-м и 135-м аминокислотными остатками, являются высококонсервативными для всех видов млекопитающих, а также кур. В частности, было по­казано, что конверсия нормального прионного белка PrP^C в его инфекционную форму (PrP^Sc ) является посттрансляционным процессом. Анализ вторичной структуры PrP^Sc выявил, что этот переход характеризуется большими структурными изменениями самого приона. Продемонстрировано, что PrP^C содержит 42% a-спиралей и почти не содержит b-тяжей (около 3%), в то время как в его инфекционной форме PrP^Sc выявляется 30% a-спиралей и 43% b-тяжей. В эксперименталь­ных исследованиях было подтверждено, что обработка нормаль­ного PrP^C реагентами, уменьшающими образование b-тяжей, также приводит к уменьшению инфекционности приона; одно­временно снижается и устойчивость к действию протеазы К, чувствительность к которой является маркером, отличающим PrP^C от PrP^Sc .

Проведенный сравнительный анализ показал, что конформационные различия между нормальным и инфекционным прионным белком заключаются в трехмерной конформации. Переход нормального PrP^C в его патологическую форму имеет в своей основе перестройку укладки белка. Корреляция изменений во вторичной структуре PrP с изменениями его инфекционности вместе с изменением конформации PrP дает основания заклю­чить, что конформация прионного белка может иметь главное значение для проявления его патогенных свойств.

Были изучены некоторые закономерности перехода клеточной формы приона PrP^C в его инфекционную форму и выявлено, что эффективность этой конверсии определяется видовой гомологией PrP^C и PrP^Sc и, следовательно, в условиях гетерологичности обеих форм прионного белка эффективность конверсии снижается. Этим и объясняется механизм низкой инфекционности прионов в гетерологичной системе (например, животные – человек). Значение этой конверсии в развитии ин­фекционного процесса было подчеркнуто в экспериментальных исследованиях, показавших, что мыши, не экспрессирующие PrP^C , устойчивы к инфекции прионами.

В исследованиях invitro, проведенных на модели агентов ТГЭ, также была установлена корреляция между эффективностью конверсии PrP^C в PrP^Sc и способностью к трансмиссии агентов скрепи, губкообразной энцефалопатии коров и болезни Крейтцфельдта – Якоба. Было продемонстрировано, что конверсия PrP^C в PrP^Sc в гетерологичной системе значительно снижена по сравнению с гомологичной системой. Авторы делают из своей сугубо экспериментальной работы практически важный вывод о том, что способность агентов скрепи и губкообразной энцефалопатии коров поражать людей после соответствующей экспози­ции является ограниченной и низкой.

Таким образом, в результате разносторонних исследований, особенно интенсивно проводившихся в 90-е годы, были получе­ны и систематизированы имеющие принципиальное значение данные о структуре и физико-химических свойствах прионных белков. Получение и анализ этих сведений создали необходи­мые предпосылки для дальнейшего углубленного изучения био­логических особенностей прионных белков и механизма разви­тия вызываемых ими заболеваний людей и животных.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРИОНОВ

В последние годы вопрос о биологическом значении PrP^C был подвергнут ревизии. На мышах, гомозиготных по потере гена PrP^C , было показано, что эти животные после рождения росли нормальными, но спустя 70 нед у них развивались про­грессирующие симптомы атаксии, нарушалась моторная коор­динация и отмечалась экстенсивная потеря клеток Пуркинье. Авторы сделали вывод о том, что PrP^C играет важную роль в вы­живании клеток Пуркинье. Помимо этого, указывается на роль PrP^C в регуляции циркадианных ритмов, на возможное участие PrP^C в активации лимфоцитов и на его роль в качестве трофического фактора для некоторых по­пуляций нейронов. Сохранность PrP^C имеет значение для реа­лизации нормальной функции синапсов. В последние годы опуб­ликованы данные, свидетельствующие о роли PrP^C в регуляции сна и продемонстрировано значение нарушения нормальной функции PrP^C в возникновении смертельной семейной бес­сонницы. В исследованиях invitro было также показано, что PrP^C вовлекается в процессы регуляции содержания внутриклеточного Са²⁺ в нейронах, Интенсивные исследования биологической роли PrP^C позволили прийти к заключению о значении нор­мального приона PrP^C в сохранении резистентности нейронов и астроцитов к окислительному стрессу.

Таким образом, за последние годы были значительно расши­рены представления о биологической значимости PrP^C . Было ус­тановлено, что PrP^C синтезируется в эндоплазматической сети и довольно быстро деградирует: продолжительность его полурас­пада составляет всего 5 – 6 ч. Синтезированный PrP^C , проходя че­рез аппарат Гольджи, транспортируется на поверхность клетки, где он связывается с гликофосфатидилинозитолом. Синтезированный PrP^C в дальнейшем переносится вдоль аксона при помо­щи быстрого антероградного транспорта. В отличие от PrP^C ин­фекционный прионный белок PrP^C первично аккумулируется в клетках, накапливаясь в цитоплазменных везикулах. Дальней­шее накопление PrP^Sc в синаптических структурах и связанная с этим дезорганизация синапсов, возможно, являются причи­ной развития глубоких неврологических дефектов и деменции.

Напомним, что заболевания, вызываемые прионами, харак­теризуются рядом признаков, сочетание которых определяется биологическими особенностями их возбудителей, это прежде всего длительный инкубационный период (от месяцев до десят­ков лет), отсутствие воспалительных изменений, хронически прогрессирующая патология, отсутствие ремиссий и выздоров­ления. Для прионных болезней характерен ряд отрицательных признаков, которые не наблюдаются при заболеваниях, вызывае­мых вирусами. К ним относятся отсутствие продукции интерферона и нечувствительность к интерферону, отсутствие в составе возбудителя инфекционных нуклеиновых кислот и неспособ­ность прионов интерферировать с вирусами. Для прионных бо­лезней характерны нечувствительность к иммуносупрессирующему или иммунопотенцирующему действию АКТГ, кортизона, циклофосфамида, g-лучей, антилимфоцитарной сыворотки, тимэктомии и спленэктомии, отсутствие влияния адъювантов. Для прионных болезней характерна также интактность В- и Т-клеток. Комбинация всех перечисленных признаков, каждый из которых не является чем-то уникальным, и определяет своеобразие прионных болезней.

Получение новых данных в отношении биологических осо­бенностей прионов позволило заключить, что прионные болезни являются нейродегенеративными заболеваниями, в возникно­вении которых фундаментальную роль играют конформационные изменения, а сам механизм развития болезни является беспрецедентным.

Результаты проведенных исследований позволили с новых позиций подойти к вопросу о природе агентов ТГЭ, а вся сумма полученных новых знаний о прионах послужила основанием для оптимистического высказывания С.Прузинера о том, что "эра черного ящика биологии скрепи и болезни Крейтцфельдта – Якоба, возможно, подходит к концу". В 1997 г. за свои много­летние исследования медленных инфекций, вызываемых при­онами, американский биохимик С.Прузинер был удостоен Но­белевской премии по биологии и медицине. Таким образом, мы встречаемся с не очень частым случаем, когда Нобелевская пре­мия присуждается дважды на протяжении 20 лет за исследова­ние одной и той же проблемы, что, безусловно, свидетельствует о значимости самой проблемы и о темпах ее изучения.

ПРИОННЫЙ ГЕН

Современный этап в исследовании молекулярных основ прионных заболеваний человека и животных связан с идентифи­кацией гена, кодирующего прионный белок. Расшифровка ами­нокислотной последовательности этого белка, позволила выяс­нить структуру кодирующей области соответствующего гена. Этот ген, получивший название PRNP, был вскоре выделен и иссле­дован в лаборатории Ч.Вэйссманна. Выделение гена PRNP позволило использовать для исследования этиологии и патогенеза прионных заболеваний весь арсенал современных методов молекулярно-генетического анализа. В настоящее время структура белка PrP и соответст­вующего гена известна для многих организмов. Ген PRNP ока­зался эволюционно-консервативным: он найден у многих мле­копитающих и птиц. В структурном отношении гены PRNP млекопитающих тоже схожи: в генах всех млекопитающих об­ласть, кодирующая PrP , локализована только в одном экзоне (экзоны - области гена, представленные в структуре зрелой иРНК). У человека этот ген локализован на хромосоме 20, у мышей - на хромосоме 2. Ген PRNP присутствует и экспрессируется не только у больных, но и у здоровых животных. При этом, несмотря на то, что иРНК гена PRNP в тканях мозга взрослых животных экспрессируется конститутивно, у молодых животных ее коли­чество меняется с возрастом. Наибольшее количество иРНК PRNP зарегистрировано в нейронах.

Примерно 10% всех прионных заболеваний человека отно­сятся к так называемым семейным формам или болезням с на­следственной предрасположенностью. Идентификация прионного гена позволила связать семейные формы этих заболеваний с конкретными мутациями в гене PRNP. Так, например, мутация, вызывающая замену пролина на лей­цин в 102-м положении PrP оказалась связана с развитием син­дрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера. Интересно, что эта мутация приводит к заболеванию не только людей, но и мышей. Мутация в 178-м кодоне может быть связана как с развитием болезни Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), так и смертельной се­мейной бессонницы. Интересно, что оба случая связаны с за­меной аспарагиновой кислоты на аспарагин. Разница, по всей видимости, заключается в том, что мутантная аллель при смер­тельной семейной бессоннице в 129-м положении несет кодон для метионина, в то время как в случае БКЯ это положение занимает кодон для валина. Наследственная предрасположен­ность к прионным заболеваниям может быть связана не только с определенными аминокислотными заменами в PrP , но и с его гораздо более существенными изменениями. Так, в аминоконцевом районе PrP имеется 5 расположенных подряд идентич­ных последова