Реферат: Про роль преоптичної області та переднього гіпоталамуса у підтримці констант гомеостазу
Розкрито біологічне значення функціонального зв’язку та взаємодії різних механізмів регуляції вегетативних функцій на рівні RPO і переднього гіпоталамуса. Вагоме превалювання в RPO і передньому гіпоталамусі полісенсорних нейронів у порівнянні з моносенсорними переконливо доводить, що в організмі не відбувається ізольовано зміна тільки одного гомеостатичного показника, й коливання будь-якої константи гомеостазу неодмінно викликає зрушення інших гомеостатичних параметрів, тому механізми підтримки різних констант гомеостазу включаються водночас і виконуються поєднано.
Дослідження конвергентних властивостей нейронів і визначення комбінацій стимулів, до яких одночасно були чутливі досліджувані нейрони, виявило наявність у RPO і передньому гіпоталамусі поліспецифічних елементів, що взагалі надає зовсім новий погляд на поняття „специфічності”, як властивості регуляторних нейронів. Але ж саме ці функціональні особливості нейронів RPO і переднього гіпоталамуса та їх діяльність під час зрушення будь-якої константи гомеостазу і визначають механізм центральної регуляції гомеостазу, який забезпечує підтримку констант гомеостазу і динамічний фізіологічний баланс при змінах навколишнього середовища.
Виявлення в RPO і передньому гіпоталамусі бісенсорних термо-глюкосенситивних нейронів, що забезпечують контроль енергоресурсів і термогенезу, пояснює посилення відчуття голоду при переохолодженні і анорексію під час лихоманки. Виявлення глюко-осмосенситивних нейронів обумовлює їх причетність до системи осморегуляції, як компонента питної поведінки, і обумовлює спрагу під час прийому їжі. Виявлення пресо-термосенситивних нейронів зумовлює кардіорефлекси (зокрема зміну артеріального тиску) при тепловому ударі; вегетативні температурні прояви при адреналіновому стресі; гіпотермію і відчуття холоду при падінні артеріального тиску внаслідок гострої крововтрати та ін.
Виявлене превалювання серед усіх трисенсорних нейронів, елементів, які одразу чутливі до термо-, глюко- та осмотичних стимулів здійснює нейронами RPO і переднього гіпоталамуса центральний контроль енергоресурсів та метаболічного стану за рахунок термогенезу та водно-електролітному обміні.
Встановлений механізм регуляції гомеостазу, заснований на взаємодії різних регуляторних систем, завдяки діяльності поліспецифічних нейронів RPO і переднього гіпоталамуса надає підставу у клініці розробляти більш ефективні шляхи лікування, які повинні бути спрямовані не тільки на встановлення зміненої константи (або констант) однієї вісцеральної системи, а також здійснювати паралельний вплив на інші вегетативні функції й вісцеральні системи організму.
Запропонований методологічний принцип аналізу ФІА нейронів може бути використаний у наукових лабораторіях під час проведення близьких за напрямком експериментальних досліджень, для вивчення часових біологічних процесів за допомогою методів доказової медицини.
Матеріали дисертації впроваджено у навчальний процес на кафедрах фізіології і патологічної фізіології ДонНМУ ім. М.Горького (акти впровадження від 05.02.2007), кафедрі фізіології людини та тварин ДНУ (акт впровадження від 14.03.2007), кафедрі нормальної фізіології ДДМА (акт впровадження від 25.01.2007), на кафедрі пропедевтики внутрішніх хвороб ДонНМУ ім. М.Горького (акт впровадження від 22.03.2007), кафедрі анестезіології, інтенсивної терапії та медицини невідкладних станів ФІПО ДонНМУ ім. М.Горького (акт впровадження від 04.04.2007).
Особистий внесок здобувача.
Автором особисто окреслено мету, визначено завдання роботи; проведені експериментальні дослідження; розроблені статистичні методики, підходи, обґрунтовано використання експериментальних пристроїв; особисто проведено обробку й аналіз отриманих результатів; сформульовані основні положення і висновки. У дисертації не використано ідеї та розробки, що належать співавторам опублікованих робіт.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що увійшли до цієї роботи доповідались та обговоренні на: II конференції Українського товариства нейронаук, присвяченій 70-річчю кафедри фізіології ДонДМУ (Донецьк, 24-27 травня 2001); XIII з’їзді фізіологічного товариства ім. Павлова (Казань, 25-28 вересня 2001); IV Всесвітньому з’їзді патофізіологів, нейроморфологів, мікробіологів (Будапешт, 2002); Х міжнародній конференції з нейрокібернетики “Проблемы нейрокибернетики” (Ростов-на-Дону, 2002); VIII Міжнародній конференції “Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы”, присвяченій пам’яті академіка О.Г. Баклаваджяна (Донецьк-Слов’янськ, 3-6 червня, 2003); Ювілейній конференції “Пурины и монооксид азота”, присвяченій 50-річчю з дня заснування Інституту фізіології Національної академії наук Білорусі (Мінськ, 7-8 жовтня 2003); Міжнародних читаннях “Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга”, присвячених 100-річчю з дня народження академіка Е.А. Асратяна (Москва; 2003); III Конференції Українського товариства нейронаук, присвяченій 75-річчю ДонДМУ (Донецьк-Слов’янськ, 23-26 травня 2005); I з’їзді фізіологів СНГ (Дагомис, Сочі, 19-23 вересня 2005); ХIV міжнародній конференції з нейрокібернетики “Проблемы нейрокибернетики” (Ростов-на-Дону, 2005); XV з”їзді Українського фізіологічного товариства, (Чернівці, 23-25 травня 2006); V Всесвітньому з’їзді патофізіологів, нейроморфологів, мікробіологів (Пекін, 2006); IV з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 19-21 грудня 2006); IX Міжнародній конференції “Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы”, присвяченій 75-річчю кафедри фізіології ДонДМУ (Донецьк-Слов’янськ, 23-25 травня 2007); III Міжнародному міждисциплінарному конгресі “Нейронаука для медицины и психологии” (Судак, АР Крим, 12-20 червня 2007).
Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 60 вітчизняних і закордонних журналах, зокрема у 2 монографіях, 20 статтях у наукових фахових виданнях, 2 деклараційних патентах, 36 статтях та тезах у збірках наукових праць, матеріалах з’їздів та конференцій.
Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, десяти розділів, висновків, списку використаних джерел та додатку; викладена на 323 сторінках комп’ютерного тексту. Робота ілюстрована 23 таблицями на 12 сторінках та 74 рисунками на 50 сторінках. Список використаних джерел містить 317 вітчизняних та іноземних найменувань на 24 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріал і методи дослідження. Дослідження проведені на 26 безпорідних дорослих кішках обох статей масою (2,5-3,2) кг в умовах гострого експерименту. Хірургічні процедури та наступний електрофізіологічний експеримент проводилися під комбінованим наркозом: внутрішньом’язово каліпсол (Сalypsol, “Гедеон Ріхтер”, Угорщина, 25 мг/кг) та інгалаційно (кисень+закис азоту). Хірургічне втручання включало венесекцію і катетеризаціюправої v. femoralis, препаровку і катетеризаціюа.carotis interna, трахеостомію, дренуванняcisternae subarachnoidalis, трепанацію черепа і часткову аспірацію мозкової тканини лівої півкулі доventriculus lateralis. Тварин переводили на штучне дихання; уподальшому крапельно вводили кетамін та міорелаксант (ардуан) у підтримуючих дозах. Електрофізіологічний експеримент проводився з урахуванням принципів Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 рр.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), Європейської конвенції по використанню хребетних тварин для експериментів (1986 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.), та законам України; про що свідчить протокол комісії з питань біоетики ДонДМУ № 166/16 від 20.04.2006. Дихальна суміш, що складалася з (70-75)% закису азоту і (25-30)% кисню, зігрівалася до температури тіла тварини, зволожувалася і подавалася в трахею за допомогою апарата штучної вентиляції легень на пневмоелементах. Цей прилад був спеціально розроблений в нашій лабораторії (деклараційний патент на пристрій № 68719 UA). Він повністю забезпечує умови адекватності зовнішнього дихання лабораторних тварин і не створює електричних перешкод при електрофізіологічному експерименті.
Імпульсну активність окремих нейронів відводили позаклітинно за допомогою скляних мікроелектродів із опором 10-20 МОм, заповнених розчином NаСІ (3 М). Введення мікроелектрода проводилося через контралатеральну півкулю під різними кутами до горизонтальної стереотаксичної площини таким чином, щоб підхід до досліджуваної ділянки забезпечував найменшу травматизацію структур гіпоталамуса. Гістологічна верифікація точок відведення проводилася згідно з атласом Джаспера та Аймон-Маршана (1954) за стандартною методикою після виготовлення послідовних фронтальних зрізів мозку.
Функціональна ідентифікація нейронів,тобто належність нейронів RPO і переднього гіпоталамуса до термо-, глюко-, осмо- і пресосенситивних, визначалася за їх реакціями, що розвивалися у відповідь на температурні стимули, підвищення рівня глюкози, коливання осмотичного тиску та підвищення системного артеріального тиску. Всі ці вісцеральні стимуляції модулювалися під час експерименту, і основною умовою при функціональній ідентифікації нейронів була невисока інтенсивність гомеостатичних змін (яка укладається у фізіологічні межі), при достатній ефективності дії.
Для функціональної ідентифікації нейронів RPO і переднього гіпоталамуса, як термосенситивнихзастосовувалося локальне нагрівання або охолодження температури шкіри подушечки передньої контрлатеральної (відносно боку відведення) кінцівки тварини, яке здійснювалося за допомогою оригінального комп’ютеризованого термостимулятора, зібраного на базі термоелектричної батареї Пельє. Підвищення або зниження температури поверхні термоелемента, до якої фіксувалася подушечка лапи, здійснювалося у межах від (-)70 С до (+)70 С щодо фонової температури. Загальна тривалість дії як правило не перевищувала 45с, швидкість наростання (спаду) температури дорівнювала 0,50 С ∙с-1 . Генералізову термостимуляцію виконували охолодженням усієї поверхні тіла, крім голови, за допомогою прокачування води низької температури через спеціальний теплообмінний кожух, у якому перебувала тварина. Глюкосенситивнінейрони виявлялися за їх реакціями на введення в a . carotis interna (0,1-0,3) мл 5,5% (0,31М) ізотонічного розчину глюкози. Доза цієї речовини складала 0,06 мМ і викликала збільшення концентрації глюкози в басейні a . carotis interna в 2,2 раза. Ідентифікація осмосенситивнихнейронів проводилася за їх реакціями на короткострокові коливання осмотичного тиску в кровотоку, які викликалися після інфузій (0,1-0,3) мл 3,0% і (0,2-0,5) мл 0,2% розчину NaCl. При введенні 200 мкл 3,0 % розчину NaCl доза речовини складала 0,1 мМ NaCl і приводила до збільшення осмолярної концентрації в басейні a . carotis interna до (+)15 мосмол∙л-1 або на 5 % від початкового рівня. При введенні такого ж об'єму 0,2 % розчину NaCl його доза складала 0,03 мМ NaCl, яка при цьому розведенні викликала зниження осмолярної концентрації на (-)4,6 мосмол∙л-1 або на 1,5 % від початкового рівня. Такі дози відповідали фізіологічним змінам у крові. Належність нейронів до системи регуляції гемодинаміки (тобто ідентифікація як пресосенситивних) визначалася за їх реакціями на підвищеннясистемного артеріального тиску. Для цього через катетер, введений в v. femoralis правої лапи інфузувалося (0,1-0,2) мл 0,002 % розчину фенілефрину гідрохлориду. Доза речовини складала (0,65-1,3) мг/кг∙с-1 . За цих умов збільшення середнього артеріального тиску щодо початкового рівня, зареєстрованого в a.carotis communis (14,7-17,3) кПа, досягало (4,0-6,7) кПа. Таким чином, приріст артеріального тиску складав приблизно 30%.
Середня доза кожного розчину, який вводився під час стимуляції з темпом інфузії 50 мкл∙с-1 , дорівнювала 200 мкл. Введення 200 мкл ізотонічного розчину NaCl (волюм-контроль) не викликало достовірних змін ФІА у жодного з нейронів, які були обрані для аналізу. Щоб уникнути взаємного впливу різних інфузій, контролювали: сумарний об'єм речовин, які вводилися під час кожного експерименту; їх послідовність й інтервали між введеннями. У кожної тварини досліджувалася активність в середньому 7-9 нейронів й проводилося не більше 25 стимуляцій з інтервалами між ними, в середньому, 8-10 хв (не менше 4 хв). Послідовність речовин, які вводилися, носила випадковий характер.
Для подразнення кортикальних структур серійними (із частотою 12,30,100 с-1 ) стимулами були використані біполярні ніхромові електроди, ізольовані за винятком кінчиків. Міжелектродна відстань становила (1-2) мм; електроди вколювалися в тканину кіркових утворень на глибину (2-3) мм. Сила стимуляції кожної з кортикальних ділянок в 2 рази перевищувала порогову для виникнення викликаних потенціалів. Позиціювання подразнюючих електродів виконувалося за координатами стереотаксичного атласу Рейнозо-Суареца (1961) у прореальній (поле 8), поясній (поле 24) звивинах, піриформній частці (періамігдалярній корі) та гіпокампі (САЗ).
Введення розчинів, вибір каналу та параметрів стимуляції, розрахунки положення кінчика електрода при його переміщенні здійснювалися за допомогою програмно-апаратурного комплексу, створеного та вдосконаленого у нашій лабораторії (Казаков В.Н. та ін., 1992, 2002). Контроль систем життєзабезпечення (моніторинг частоти серцевих скорочень, артеріального тиску, параметрів штучної вентиляції легень, підтримка температури) також здійснювався комп’ютером у відслідковуючому режимі. Активність нейронів реєстрували тільки у тому випадку, якщо фонова імпульсація мала стабільний характер протягом не менше кількох хвилин. Реєстрація здійснювалася на протязі: 30 с – фону, (4-5) с – стимуляції (температурна тривала довше), 60 с – періода післядії.
Статистичному аналізу підлягали два основних параметри ФІА: характер часової структури та середня частота імпульсації. Вірогідність розходжень значення середньої частоти імпульсної активності нейронів, яка розраховувалася до, під час стимуляції, та в період післядії визначалася за допомогою критерію U (Вілкоксона-Манна-Уітні); розходження вважалися значущими при РU <0,05.
Для аналізу характеру часової структури ФІА нейронів був спеціально розроблений статистичний метод дослідження, заснований на критеріальній оцінці рівня значущості відмінності (деклараційний патент на винахід № 3092 UA). За допомогою комп'ютерної програми обчислювали медіану частот у двох епохах: ФІА протягом 30 с й імпульсна активность протягом 30 с відразу після закінчення стимуляції. За гістограмами середньої частоти імпульсної активності нейрона (з біном 1с) розраховували відносне відхилення поточної частоти у кожному біні від медіани частоти у цьому періоді аналізу. Отримані результати відображали на двох додаткових “гістограмах розподілу відхилення” (перша відображала аналіз ФІА, друга – імпульсна активность після стимуляції). Гістограми будували таким чином, щоб частота, яка відповідає середній (тобто відхилення від медіани частот дорівнює нулю) відкладалася у центрі графіка на відмітці ∆0%. Інші крапки, що характеризували відхилення від медіани частот на + 10, + 20…+ 100 % розташовувалися на гістограмах відповідно по обидва боки від нульової відмітки. За допомогою кластерного аналізу (методом К-середніх), усі одержані гістограми розподілу відхилення підсумовувалися; і було виділено три варіанти гістограм відхилень, які значно відрізнялися один від одного. Для перших двох варіантів було побудовано теоретичні функції розподілу. За критерієм згоди Пірсона (ч2 ) при використанні комп’ютерної програми “MedStat ” (Лях Ю.Е., Гур’янов В.Г., 2004), порівнювали експериментальні гістограми розподілу відхилення з теоретичними функціями і виявляли рівень значущості відмінності. Якщо гістограма розподілу відхилення імпульсації не була відмінною від теоретичної функції першого чи другого варіанту більш ніж на 5%, то тип такої імпульсації визначався як перший або другий (відповідно). Якщо, одержана гістограма розподілу відхилення значно відрізнялася від обох теоретичних функцій, то тип імпульсації визначався, як третій. Як правило, гістограми розподілу відхилень третього типу ФІА мали кілька виражених мод і нам не вдалося у таких нейронів визначити будь-який один характерний тип гістограм розподілу відхилень.
Результати досліджень та їх обговорення. Позаклітинно відводили ФІА нейронів, зареєстрованих в RPO та прилеглих до неї гіпоталамічних структурах – латеральному і медіальному преоптичних ядрах, зоні bed nucleus stria terminalis , зоні перивентрикулярного гіпоталамічного ядра, зоні супраоптичного ядра, латеральній та дорсомедіальній області переднього гіпоталамуса в межах фронту (10,5-15,5) за атласом Джаспера та Аймон-Маршана (1954). Всього була зареєстрована ФІА 210 нейронів. Із аналізу виключили 63 нейрони, які мали частоту імпульсації нижче 0,2с-1 . Відведення ФІА ще від 53 нейронів тривало стабільним недовгий час, і це не дозволило здійснити повну програму тест-стимуляції. Всього, в роботі було оцінено та проаналізовано 1733 реакції нейронів RPO і переднього гіпоталамуса; з них було проаналізовано 577 реакцій нейронів у відповідь на зміни констант гомеостазу, і 1156 реакцій у відповідь на електричні кортикальні подразнення. Розподіл нейронів за вказаними областями переднього гіпоталамуса і RPO знаходився у кореляції з розміром кожної області. В LPO – було зареєстроване 12,8% всіх нейронів, в MPO – 13,8%, в BNST – 8,5%, в області SO – 6,4%, в Ре – 9,5%, в HL 32% нейронів, в aHd – 17%.
Застосування методу критеріальної оцінки ФІА вісцеросенситивних нейронів RPO і переднього гіпоталамуса дозволило виділити три типи ФІА цих нейронів залежно від особливостей їх часової структури, які значно відрізнялися один від одного. У нейронів із першим типом ФІА реєструвалася безперервна і відносно рівномірна імпульсація, зі схожими за тривалістю міжімпульсними інтервалами. Другий тип ФІА нейронів відрізнявся від першого неритмічністю імпульсації з великими та маленькими міжімпульсними інтервалами. У нейронів із третім типом ФІА реєструвалася нерівномірність генерації імпульсів, вони спорадично генерувалися частіше або рідше.
Здійснення вісцеральної стимуляції, або надання серійних електричних кортикальних подразнень викликало у нейронів RPO і переднього гіпоталамуса реакції, які складалися у перетворенні часової структури (типу) ФІА і/або коливання частоти ФІА. Достовірна перебудова ФІА нейрона у відповідь на температурну стимуляцію, підвищення рівня глюкози, коливання осмотичності плазми та підвищення системного артеріального тиску дозволяло характеризувати вісцеросенситивність цього нейрона. Серійні кортикальні подразнення використовувалися як тест на стабільність імпульсації нейрона.
Під час аналізу часової структури ФІА нейронів RPO і переднього гіпоталамуса були виділені нейрони, у яких виявлявся перший або другий тип ФІА; і після стимуляції цей тип імпульсації зберігався, що було доведено за допомогою статистичного критерію – рівня значущості відмінності. Також, виявлялися нейрони, в яких у відповідь на стимуляцію змінювався тип ФІА у різних варіантах (із першого на другий, із другого на третій та ін.)
Наші дані свідчать про те, що за умов гомеостатичних змін у 15% нейронів RPO і переднього гіпоталамуса зберігався тип ФІА і у 25% – він змінювався. Після кортикального подразнення тільки у 4% нейронів RPO і переднього гіпоталамуса тип ФІА зберігався і у 34% – змінювався.
Середня частота ФІА у нейронів гіпоталамуса знаходиться у досить великому діапазоні: від 0,2 до 40 с-1 . Одним із важливих параметрів оцінки стабільності ФІА нейронів є незмінність середньої частоти імпульсації. У цій роботі застосовано особливий методологічний підхід до оцінки реакцій гіпоталамічних нейронів. У кожного нейрона ми оцінювали середню частоту імпульсної активності під час стимуляції, та імпульсну активність у двох 30-ти секундних епохах після закінчення стимулу: період післядії та період відновлення. Далі ми порівнювали ці показники із середньою частотою ФІА протягом такого ж терміну. Коливання частоти імпульсної активності у порівнянні з ФІА на + 40% характеризували як реакцію нейрона на подразнення у вигляді гальмування або активації.
Структура реакцій нейронів RPO і переднього гіпоталамуса, що складалися у коливанні частоти імпульсації у відповідь на вісцеральні впливи та кортикальні подразнення виявилася достатньо різноманітної. Реакція першого типувиглядала як відносно короткочасне підвищення або зниження частоти імпульсної активності, що було зареєстровано безпосередньо під час надання стимулу (іноді, протягом 5-7 с після його закінчення). Реакції другого типу складалися у коливанні частоти імпульсної активності у післядії. При цьому, у будь-яких нейронних реакціях, зміна частоти імпульсації не виявлялася безпосередньо під час надання стимулу, а виникала лише після його закінчення. У інших випадках коливання частоти виникало відразу під час надання стимулу і зберігалося у післядії. Іноді напрямок реакції у цих періодах трансформувався, тобто спостерігався on - off -ефект. Як правило, за умов вісцеральної стимуляції реакції нейронів мали тонічний характер і були більш тривалими й менш виражені за амплітудою, тоді як реакції у відповідь на кортикальні подразнення викликали більш короткочасні й інтенсивні зміни частоти ФІА.
В цілому, за умов вісцеральної стимуляції було зареєстроване коливання частоти ФІА у 72% нейронів RPO і переднього гіпоталамуса й у 28% нейронів частота ФІА достовірно не змінювалася. У відповідь на кортикальні подразнення було зареєстроване коливання частоти ФІА у 95% нейронів RPO і переднього гіпоталамуса, й у 5% нейронів частота ФІА достовірно не змінювалася.