Реферат: Программируемая клеточная смерть
Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз – семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты (см. обзоры [33–35]). На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5), б) каспазы-2 (каспаза-2) и в) каспазы-3 (каспазы 3, 6–10) [36]. Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений [37]. Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз [38, 39].
В результате действия каспаз происходит [33–36]:
активация прокаспаз с образованием каспаз;
расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD или DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется [40], и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах – 180-200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную "лесенку ДНК". Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК [2]. Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 (протеолиз при Asp 1093) и неидентифицированной протеазы (протеолиз при Ser 987) образуется фрагмент Ser 987 – Asp 1093. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК [41, 42];
гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;
разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;
инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК (см. обзоры [3,11]). Донором ADP-рибозы является NAD+ . Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+ , ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.
Существует несколько путей реализации программы ПКС [2, 34, 43–46].
1. Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы [34, 47–52], специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ’ рецепторы ’ адаптеры ’ каспазы первого эшелона ’ регуляторы ’ каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН -1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL– лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF – tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L.
Fas – член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов (рис. 2). Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).
Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain – домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков [45, 46]. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP – receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через CARD-домены [ 45, 46, 51].
Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL – Fas – FADD – прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами [43], апоптозными шаперонами [53], или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC – death-inducing signaling complex) [49].
Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы [34, 43, 54]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга) [34, 43, 54]. В результате от прокаспазы (молекулярная масса 30–50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы (рис. 3). Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8.
Существуют другие пути активации каспазы-8 – с участием рецепторов TNFR1 и DR3 [51]. Однако эти пути, включаемые одним и тем же адаптером TRADD, конкурируют с параллельными путями активации ядерных факторов транскрипции NF-єB (nuclear factor kappa B) и JNK/AP-1 (JNK, Jun-N-концевая киназа, является компонентом митоген-активируемого киназного пути, ведущего к активации фактора транскрипции AP-1), зависимыми от адаптеров RIP и TRAF (TNFR1-associated factor).под контролем этих факторов транскрипции находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- или Apo3L-индуцированную активацию каспазы-8. Предполагаются следующие пути передачи про- и антиапоптозных сигналов [51]:
На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона (см. обзоры [36, 52, 55–58]). К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL , Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS , Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок Geodia cydomium и Suberites domuncula , у которых апоптоз необходим для морфогенеза [59].
Каспаза-8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. Рис. 4 иллюстрирует взаимодействие между каспазами первого и второго эшелона. Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), активирует ряд других протеаз семейства каспаз, активирует фактор фрагментации ДНК, ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов,осуществляющих апоптоз.
2. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy)митохондрий [34, 55, 58, 60, 61]. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор [62]. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор [60]. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорелирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca2+ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами [60]. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема [63]. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с [64–66], прокаспазы 2, 3 и 9 [67, 68], белок AIF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа [69]. Прокаспаза-3 обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме [67].
Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается [61], что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны (ср. с гипополяризацией при раскрытии гигантских пор). Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства [61].
Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9 [70]. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD – дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце [71], образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР [70] (концентрация dATP в клетке в 1000 раз ниже концентрации АТР [72]). К наиболее охарактеризованным WD-белкам относится b -cубъединица G-белков. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера (см. обзор [73]). WD-Повторы свойственны белкам, участвующим в регуляции деления и дифференцировки эукариотных клеток, транскрипции генов, модификации мРНК, трансмембранной передачи сигналов, слияния мембранных везикул. Среди прокариот WD-белки обнаружены у цианобактерий [74, 75].
APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9 [76–78]. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с (рис. 5). Связав цитохром с , APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APAF-1 [76]. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с -комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9 [76-78]. Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у червя Caenorhabditis elegans [79] –аналога прокаспазы-9 млекопитающих. Альтернативный вариант – прокаспаза-9, связавшись с апоптосомой, может принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации) [77]. Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3. Мутантный APAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3 [77].
Флавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс – высвобождение цитохрома с и каспазы-9 [69]. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, диссипации Dy в митохондриях и переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружный. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептидным ингибитором каспаз N-бензоилоксикарбонил-Val-Ala-Asp.трифторметилкетоном (Z-VAD.fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом с . Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором ПКС у животных, действующим независимо от каспаз [69].
Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу [80]. Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы. Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+ , а с О2 в качестве акцептора электронов. При этом образуются О2 A, Н2 О2 , а из них – и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируетсяADP [81]. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О2 A, достигает 1-5 % (см. [61]). Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О2 A – генерирующую NADPH-оксидазу.
В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают разные типы клеток [82]. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются ПКС по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с [82]. ПКС, вызванная химиотерапевтическими соединениями, УФ- или і-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fas-рецептора [83–86].
Некоторые клетки, например, клетки эмбриональной нервной системы, включают механизмы апоптоза, если они испытывают дефицит апоптозподавляющих сигналов (называемых также факторами выживания) от других клеток. Физиологический смысл процесса – в элиминации избыточных нервных клеток, конкурирующих за ограниченный фонд факторов выживания. Эпителиальные клетки при отделении от внеклеточного матрикса, вырабатывающего факторы выживания, тоже обречены на ПКС. Факторы выживания связываются соответствующими цитоплазматическими рецепторами, активируя синтез подавляющих апоптоз агентов и блокируя стимуляторы апоптоза [44]. Некоторые вещества (например, стероидные гормоны) оказывают дифференцированный эффект на различные типы клеток – предотвращают апоптоз одних типов клеток и индуцируют его у других [2].
Так, при наличии во внеклеточном матриксе факторов роста PDGF (platelet-derived growth factor – тромбоцитарный фактор роста) или NGF (nerve growth factor – фактор роста нервов) и цитокина интерлейкина-3 (IL-3) проапоптозный белок Bad не активен (см. обзор [58]). Факторы роста, связавшись со своим рецептором на плазматической мембране, вызывают активацию цитозольной протеинкиназы В, обозначаемой Akt/PKB/RAC и катализирующей фосфорилирование Bad по Ser-136. IL-3 тоже связывается со своим рецептором на плазматической мембране и активирует митохондриальную cAMP-зависимую протеинкиназу А (РКА), катализирующую фосфорилирование Bad по Ser-112. Будучи фосфорилированным по обоим остаткам серина, Bad образует комплекс с белком 14-3-3, располагающийся в цитоплазме. Дефицит факторов роста и IL-3 воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу: происходит дефосфорилирование Bad, его внедрение в наружную мембрану митохондрий, выход цитохрома с из митохондрий и последующая активация каспазы-9 через APAF-1-зависимый механизм. Кроме этого дефицит IL-3 вызывает перемещение мономерного проапоптозного белка Bax из цитоплазмы в наружную мембрану митохондрий, последующая сшивка молекул Bax с образованием гомодимеров тоже ведет к выходуцитохрома с из митохондрий и гибели клетки.
3. В ряде случаев ПКС реализуется в результате комбинированного действия двух путей – с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цитохрома с . Так, повреждение ДНК ведет к накоплению в клетке белкового продукта гена р53, который может останавливать деление клеток и/или индуцировать апоптоз (см. обзоры [87–89]). У более чем 50% изученных видов опухолевых клеток ген р53 инактивирован [44], у них нарушена р53-зависимая регуляция клеточного гомеостаза.
Белок р53 является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов. Предполагается, что ответная реакция на образование белка р53 зависит от степени нарушения клеточного генома [89]. При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование. При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром с -зависимый апоптозные каскады активации каспаз.
Различные пути апоптоза могут взаимодействовать между собой. В некоторых случаях зависимый от рецепторов путь ведет к малоэффективной активации прокаспазы-8. В этом случае подключается зависимый от митохондрий путь апоптоза: каспаза-8 (образовавшаяся в небольших количествах) взаимодействует в цитоплазме с белком Bid из семейства Bax, расщепляя его надвое. С-Концевой домен Bid далее внедряется в митохондриальную мембрану, индуцируя выход цитохрома с из митохондрий и его связывание с APAF-1 [43, 58].
4. Существует путь передачи сигнала ПКС с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР) [90, 91]. В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca2+ -гомеостаза добавкой тапсигаргина или Ca2+ -ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызв?