Реферат: Развитие антимикробной химиотерапии и новые парадигмы

Система IVET, основанная на захвате промотора тех генов, которые экспрессируются только invivo, позволила обнаружить, например, у сальмонелл примерно 1% таких генов. Системы обнаружения ivi генов, основанные на разных подходах, разрабатываются в разных лабораториях. В число генов вирулентности входят не только гены, кодирующие образование адгезинов, инвазинов и т. п., но и гены, позволяющие микроорганизму переносить дефицит необходимых веществ в макроорганизме, например, гены системы транспорта железа, реутилизации пуринов.

Несомненно, что на парадигмах современной химиотерапии, а точнее – химиотерапии ближайшего будущего должно сказаться развитие протеомики [9,10,11].

Протеомика в обязательном сочетании с молекулярной биологией, геномикой и белковой химией знаменует качественно новое углубление знаний во всех областях биологии, в том числе и микробиологии. Как правило, в статьях, посвященных вопросам протеомики, подчеркивается, что ее развитие становится возможным. Более того, оно неизбежно именно в "постгеномную" эру.

Если геномика основана на дифференциации каждого гена из их совокупности в геноме и его характеристике в разных аспектах с использованием баз данных, то протеомика – на дифференциации и характеристике клеточных белков также с использованием баз данных.

Протеомика, говоря с некоторой долей условности, ближе к познанию фенотипа клетки, выращиваемой в конкретных условиях или находящейся под воздействием тех или иных стрессовых факторов. Обнаружение гена само по себе еще не означает, что он экспрессируется в любом случае, то есть что его продукт должен приниматься во внимание всегда. В то же время обнаружение кодируемого геном продукта и определение его количества, как правило, должно учитываться при характеристике свойств клетки.

Стандартный анализ протеома начинается с извлечения растворимых белков и их разделения и визуализации методом двумерного электрофореза в геле. Индивидуальный белок после предварительной обработки анализируется методами масс-спектрометрии или другими методами (капиллярная жидкостная хроматография). Идентификация белков осуществляется с использованием опять-таки соответствующих баз данных.

Такая методология позволяет уловить ответ клетки по качественным и количественным изменениям белковой экспрессии на всевозможные внешние воздействия, включая реакцию на добавленный антибиотик, на факторы иммунитета; улавливаются также по характеру белковой экспрессии изменения, ведущие к патогенности, антибиотикорезистентности и т.д.

Одна из важных задач протеомики – контроль за посттрансляционными модификациями белков. С помощью баз данных привлекшие к себе внимание белки классифицируются по функциям, внутриклеточной локализации и другим показателям, характеризующим их роль.

Техника двумерного электрофореза требует, однако, в ряде случаев усовершенствования. Например, ведется поиск особых приемов для улучшения идентификации гидрофобных (связанных с мембранными структурами) белков.

Актуальным является уменьшение трудоемкости анализа совокупности белков микробной клетки, поскольку в ней насчитывается несколько тысяч индивидуальных белков. Тем не менее уже достигнута идентификация в одном эксперименте около 2000 белков.

В последнее время стала развиваться количественная протеомика, позволяющая количественно сопоставлять экспрессию отдельных белков. В целом протеомика не только дополняет геномику, ее направление, которое получило название "метаболической" или "функциональной", но и является этапом (не последним) приближения к пониманию клетки как единой динамичной совокупности макромолекулярных структур.

Возможно, что в будущем предстоит терминологическое оформление и "постпротеомной" эры, когда предметом внимания окажется состав и количественное соотношение (на данный момент ростового цикла) всех низкомолекулярных метаболитов – продуктов ферментативных реакций. Учитывая, что реалии химиотерапии очень часто базируются на препаратах, являющихся аналогами ферментных субстратов, можно также ожидать принципиального вклада в химиотерапию будущего.

Интересно отметить, что основополагающие факторы, касающиеся механизма действия пенициллина, как потом оказалось, применимые и к другим b-лактамным антибиотикам, были получены более чем за треть века до формирования протеомики именно в соответствии с методологией этой, неизвестной тогда, научной дисциплины. В тот период, когда было установлено, что пенициллин, являясь ингибитором D-аланинтранспептидазы, прекращает образование пептидогликана клеточной стенки у бактерий, и когда внимание сосредоточилось на пенициллине как аналоге субстрата в активном центре этого фермента, совершенно неожиданно возник новый, как будто бы излишний, термин – "пенициллинсвязывающие белки".

Методами электрофореза (в сочетании с радиоизотопными) была показана необходимость учета топографии всей микробной клетки при установлении механизма действия b-лактамов. Множественность D-аланинтранспептидаз, одинаковых по каталитической функции, но не по молекулярной массе и другим физико-химическим свойствам, отвечающих за завершение синтеза пептидогликана на полюсах клетки, или при формировании клеточной перегородки, или при удлинении палочковидных форм, оказалась крайне важной. Они обладали неодинаковым сродством к разным b-лактамам. В конечном счете это сыграло определяющую роль в том, что b-лактамы стали наибольшей по разнообразию и значимости группой антибиотиков.

Роль протеомики в химиотерапии в будущем может быть связана с решением многих проблем, стоящих перед наукой. В качестве примера следует указать на назревшую необходимость изучения методами протеомики клеток Helicobacter pylori при микроэволюции этого патогена в инфицированном организме [12].

Известно, что культура H.pylori при стрессовой ситуации invivo дифференцируется как бы на две субпопуляции – одна часть клеток гибнет и лизируется, другая же часть адаптируется и поглощает ДНК, освободившуюся из лизировавшихся клеток. Предполагается, что общий сигнал для популяции – "quorum santis" – обеспечивает выживание культуры в трудных условиях за счет обогащения генома компетентных клеток. Однако для того чтобы подтвердить биологическое значение этого явления требуется изучить экспрессию поглощенных генов, используя методы протеомики, в частности количественной.

Широкое использование подходов со стороны не только геномики, но и протеомики необходимо для выяснения причин современной эпидемии туберкулеза. Это относится как к характеристике протеома клеток микобактерий, например, доказательство реальности компенсаторных мутаций и изучение их фенотипического выражения, так и к проблеме гетерогенности человеческой популяции в отношении восприимчивости к туберкулезу [13].

Число таких приложений методологии протеомики непосредственно к решению задач химиотерапии велико. Целесообразно тем не менее упомянуть о протеомике применительно к биогенезу вторичных метаболитов с антибиотическими свойствами у актиномицетов. Проблема экспрессии "молчащих" генов, включенных в биогенез антибиотических структур, может быть очень важна для пополнения перечня природных химиотерапевтических веществ.

Напрашивается возможность сопоставления генов, экспрессия которых играет роль в приспособлении патогенного микроорганизма к действию неблагоприятных факторов invivo, и в приспособлении почвенного микроорганизма к меняющейся внешней среде.

Проблема становится, таким образом, общебиологической. Прикладные же цели здесь разные: поиск генов, то есть их белковых продуктов как новых мишеней для химиотерапевтических веществ, и поиск генов, то есть кодируемых ими ферментов, включенных в биогенез еще не описанных химиотерапевтических агентов.

Как следует из всего изложенного, ведущую роль в каждом новом направлении, от которого ожидается прогресс антимикробной химиотерапии, играют не микробиологи. В одном случае – это химики-органики и биоорганики, в другом – генетики, в частности генные инженеры, в третьем – специалисты по белковой химии и биохимики. Используя методологию комбинаторной химии, геномики и протеомики, они с полным основанием указывают на реальность новых подходов к получению антимикробных агентов.

И все же самая блестящая разработка теоретических основ этих подходов еще не означает непосредственного вклада в практику. Последний может задержаться из-за недостаточного внимания к особенностям микробной клетки в целом и особенностям конкретного патологического процесса.

Образно говоря, намерения фундаментальных наук декларированы, а мощь их методологии продемонстрирована. Настала очередь существенного практического вклада в решение актуальных проблем химиотерапии.

Как своего рода образец для сравнения поисковых стратегий, разделенных полувековым периодом, и в связи с недавно отмеченным 50-летним "юбилеем цефалоспоринов" небезынтересно вернуться к истории открытия цефалоспоринаС [14,15]. Она является примером самоотверженного труда без далекоидущих теоретических построений: в то же время цефалоспорины четырех поколений являются полусинтетическими вариантами этого цефалоспорина. Его открытие – цепь случайностей и счастливого выбора правильного направления исследований.

Ошибочная в целом концепция самоочищения морской воды за счет антибиотиков, образуемых морскими микроорганизмами, в сочетании с отсутствием заболеваний брюшным тифом у купающихся вблизи места сброса сточных вод привели к обнаружению в Сардинии гриба – продуцента цефалоспоринаС.

Этот антибиотик малоактивен вообще и совершенно неактивен против возбудителя брюшного тифа. Образовывался он в малых количествах и был к тому же "замаскирован" присутствием антибиотических тритерпеновых структур (уже известных к тому времени) и пенициллинаN. Он был выделен как случайно обнаруженная микропримесь в препаратах пенициллинаN. Его ценность сама по себе отсутствовала, и понадобилось проявить интуицию и энтузиазм, чтобы изучать эту структуру.

Как вспоминал многие годы спустя один из авторов препарата Э.Абрахам, только чудо могло решать все новые и новые проблемы, с которыми сталкивались на пути к цефалоспоринам (не зная, что со временем цефалоспорины составят не менее половины применяемых в клинике антимикробных антибиотиков). Здесь же Э.Абрахам отдал должное правильной организации прикладной науки: "Успех – в интуиции, терпеливости и готовности идти на риск фармацевтических компаний" [14].

Действительно, первоначальное финансирование университетских исследований (в Оксфорде) было дополнено после подтверждения ценности препарата непосредственным участием на поздних стадиях его разработки лабораторий фирмы "Lilly".

Создание принципиально новых лекарственных препаратов инновационными путями в XXI веке будет, несомненно, наиболее успешным при интернационализации исследований.

Список литературы