Реферат: Регистрация сигнальных молекул
рGV3850
тДНК:
рBR322 маркер Ар, Тс
2.1.3. Растения
В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).
Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре 18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты двудольные растения табака красного и льна долгунца.
2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений
В работе использовали среды:
1. Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
| NaCl Дрожжевой экстракт Бантотриптон | 10 мг/л 5 г/л 5 г/л |
рН 7,5
Температура 240 С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
| LB штамм | 10 мл 1 мл |
2. Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена в таблице.
2.1.5. Другие растворы
Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.
Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.
2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии
Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.
2.1.7. Антибиотики
Ампицилин 50, Н2 О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.
2.2. Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений
Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600 – 0,05.
После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях.
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens
ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ–буфере.
2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну
В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага l, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.
2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli
Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370 С до концентрации 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.
3. результаты
Для обнаружения процессин?