Реферат: Рекомбинация и генетический анализ бактериофагов
Выполнил: студент ΙVкурса
ФВМ и Б специальности
«Микробиология» Акжигитов А.С.
Проверил: преподаватель кафедры
микробиологии Капустина О.А.
Оренбург 2010
Содержание
Введение
1. Рекомбинация у бактериофагов
2. Генетический анализ бактериофагов
Заключение
Список литературы
Введение
В основе наследственной изменчивости бактериофагов помимо мутации лежит рекомбинация. Рекомбинация у бактериофагов – это физическое взаимодействие геномов в смешанно-инфицированных клетках. При этом происходит обмен генетическим материалом или его частью между двумя (часто близкими) отличающимися по наследственным свойствам вирусами. Рекомбинация между родительскими геномами приводит к возникновению новых сочетаний генов в дочерних геномах, т. е. формированию нового генома. Рекомбинация путем включения одной молекулы ДНК в другую происходит между вирусной ДНК и ДНК клетки-хозяина. На этом основан метод искусственной рекомбинации молекул ДНК
В последнее десятилетие ДНК-вирусы человека и животных стали привлекать внимание генетиков как модель для изучения рекомбинации в клетках животных, особенно в связи с деталями механизма разрыв – воссоединение. В силу известной гетерогенности вирусных популяций в процессе их размножения в клетках могут создаваться условия не только для генетических, но и негенетических взаимодействий. Последние вызывают большое разнообразие фенотипических изменений, которое, маскируя истинный генотип вируса, влияет на результаты генетических исследований. Поэтому негенетические взаимодействия вирусов традиционно включаются в раздел анализа изменчивости вирусов в результате их взаимодействия друг с другом. Негенетические взаимодействия описаны у широкого круга вирусов и могут происходить между гетерогенными их группами и даже между РНК- и ДНК-содержащими.
1. Рекомбинация у бактериофагов
При взаимодействии бактериофагов друг с другом наследуемые изменения возникают в основном как результат истинных рекомбинаций. У вирусов животных и человека в зависимости от физической организации генома рекомбинация осуществляется двумя механизмами. Бактериофаги, геном которых представлен линейной молекулой ДНК или РНК, используют механизм интрамолекулярной рекомбинации, известный как механизм «разрыв — воссоединение». Бактериофаги с сегментированным геномом (ортомиксовирусы, реовирусы, буньявирусы, аренавирусы) используют механизм случайной пересортировки сегментов (генов) без разрыва ковалентных связей.
Механизм «разрыв — воссоединение» впервые сформулирован А. Херши в связи с анализом потомства смешанного заражения h-и r-мутантами фага Т2. Обнаружив, что в этом потомстве кроме частиц двух родительских типов присутствуют частицы h+r+ и hr, он предположил, что геном бактериофага состоит из расположенных в линейном порядке генов, каждый из которых несет генетическую информацию о каком-либо признаке вируса. При смешанном заражении бактериальной клетки два «сосуществующих» фаговых генома могут обмениваться между собой гомологичными участками в результате разрыва двух линейных структур в точно соответствующих точках между генами, определяющими г+- и h+-признаки, и последующего перекрестного воссоединения фрагментов. Такой перекрест или кроссинговер генетического материала может происходить в любой точке двух различных генетических структур.
Гипотеза «разрыв — воссоединение» была подтверждена позже на опытах по смешанному заражению меченым фагом. R. Holliday, Н. Potter, D. Dressierпредложили универсальную модель одно- и двухцепочечного обмена между двумя линейными молекулами (рис. 1), согласно которой рекомбинация — такой же многоэтапный процесс, как и мутация. Она начинается с разрыва цепей ДНК каждого партнера с помощью нуклеаз, на этом месте происходят перекрещивание цепей и сшивание концов, затем точки скрещивания перемещаются за счет расплетения и сплетения спиралей и вращаются вокруг точки пересечения, создавая при этом симметрическую структуру — «хи»-интермедиат. В зависимости от того, на какую ось интермедиата (вертикальную или горизонтальную) действуют нуклеазы, образуемый после разделения и сшивания рекомбинант будет гетерозиготным либо по одной, либо по двум цепям.
Из ДНК-вирусов с линейной молекулой генома рекомбинационный процесс хорошо изучен герпес- и аденовирусов, которые рекомбинируют как с близкородственными, так и неродственными вирусами.
Генетическая рекомбинация между аденовирусами человека происходит с высокой частотой при продуктивной инфекции культур клеток. Причем рекомбинация наблюдается внутри одного серотипа или между близкородственными серотипами одной подгруппы, что связывают с отсутствием гомологичных последовательностей в геномах вирусов разных подгрупп, хотя общая их организация сходна. Было опрделено, что на рестрикционной карте ts+-peкомбинантов Ad5 и Ad2 предполагаемые сайты находятся в фрагменте размером около 20 п. н., занимающем участок соединения С-конца гена PV1 и N-конца гексонового гена. Сравнительное секвенирование аналогичных фрагментов трех независимых скрещиваний выявило, что в каждом случае непосредственное участие в рекомбинационном процессе принимала лишь небольшая его часть (от 45 до 156 п. н. в длину), соответствующая участкам полной гомологии ДНК.
Герпесвирусы занимают более выгодное положение: ДНК разных серотипов способны в одинаковой степени трансфицировать культуры клеток, имеют значительные участки гомологии и рекомбинируют с большой частотой. Создавались как межтиповые, так и внутритиповые рекомбинанты, с помощью которых картировались генные функции, контролирующие репликацию вируса, морфологию бляшек, резистентность к антивирусным лекарствам. R. Thompsonкотрансфекцией ДНК одного штамма с разными рестрикционными фрагментами другого получили рекомбинант, позволивший локализовать функцию повышения нейровирулентности.
Метод получения межтиповых рекомбинантов полиовирусов разработан V. Agolс сотрудниками на основе коинфицирования клеток gs-мутантом одного серотипа и gr-мутантом другого с последующей селекцией gr-клона из урожая двойной инфекции. Таким способом получена серия межтиповых рекомбинантов, сайты скрещивания которых были локализованы в центральной части генома между локусом антигенной специфичности (5'-сторона) и чувствительностью к гуанидину (3'-сторона). Определены первичные структуры скрещиваемых регионов, длина которых варьирует между 2 и 32 нуклеотидами. Сайты скрещивания оказались распределенными по геному неравномерно. Так, внутри гена полипептида 2А обнаружен только один такой участок, в то время как в других регионах выявлялись явные их скопления, что указывало на существование предпочтительных сайтов для рекомбинации.
Используя тот же принцип, V. Agolе. а. (1984) получали внутритиповые рекомбинанты между аттенуированным и нейровирулентным штаммами полиовирусов, изменения нейровирулентности которых определили интрацеребральным заражением обезьян. Показано, что рекомбинанты, унаследовавшие 5'-половину генома от вирулентного родителя, проявили нейровирулентный фенотип независимо от происхождения 3'-половины, а рекомбинанты с 5'-геномной половины от аттенуированного родителя имели аттенуированный фенотип. Следовательно, большие детерминанты нейровирулентности находятся на 5'-половине генома, а на 3'-половине — минорные или модулирующие детерминанты.
Таким образом, детальный анализ межтиповых и внутритиповых рекомбинантов полиовирусов представил окончательные доказательства истинности рекомбинации, опроверг случайность процесса, показал, что скрещивания происходят в определенных, хотя и многих сайтах.
Интромолекулярная рекомбинация зафиксирована и у вируса гриппа. Были обнаружены последовательности сегментов ДИ РНК, составленные из последовательностей от двух нормальных геномных сегментов.
Кроме того, К. Shimizuе. а. представили доказательства существования внутрисегментной комплементации между ts-мутантами вируса гриппа. По их данным, 83 ts-мутанта образовывали 13 комплементационных групп и 8 рекомбинационных. При этом четыре рекомбинационные группы включали вирусы, представляющие более чем одну комплементационную группу, а группа Н – в каждом комплементационном члене имела по четыре ts-локуса. Мутации с внутрисегментной комплементацией обнаружены в большинстве генов (РЗ, PI, P2, NA, NPи NS).
Относительно механизма внутрисегментной комплементации высказывались различные гипотезы. Считалось, что она проявляется: 1) если сегмент полицистронен (известно, что два сегмента (7, 8) генома вируса гриппа А кодируют по два белка Ml, M2 и NS1, NS2, но, внутрисегментная комплементация отмечена и при мутациях в генах, содержащих информацию для единственных белков) ; 2) если множественный белок состоит из смеси аллельных белковых субъединиц, кодируемых двумя комплементарными родительскими генами; 3) если родительские комплементарные вирусы несут мутации в генах, кодирующих белки с несколькими функциональными доминантами.
Много неясного остается и в другом механизме рекомбинации вирусов человека и животных — реассортименте. У вирусов с сегментированным геномом каждый сегмент — это независимая и самостоятельная молекула. Полагают, что в зараженных клетках существует активный механизм, регулирующий, чтобы каждый вирион получил из клеточного пула по одной копии всех сегментов. Можно предполагать, что перекомбинация генов осуществляется на стадии морфогенеза вирусов и этот процесс также зависит от клеточных факторов. К тому же выявить участие в этом процессе вирионных белков или каких-либо последовательностей нуклеотидов, способствующих ему, не удалось.
Из вирусов с сегментированным геномом рекомбинационный процесс наиболее детально изучен у ортомиксовирусов и реовирусов. Исследования на ортомиксовирусах начаты F. Burnet(1960) еще задолго до установления сегментированности их генома. Он получил ряд основополагающих данных, вплоть до предсказания структуры генома. В этих опытах потомство смешанной инфекции двумя штаммами, один из которых (WSN) был нейротропным, оказалось способным вызывать смертельную инфекцию при заражение мышей в мозг, но имело серологическую характеристику пневмотропного MELштамма. При прямой и обратной рекомбинации этих штаммов, различающихся по семи признакам, обмен происходит как бы по двум сцепленным признакам. Одну группу сцепления составляли признаки, определяющие серологическую специфичность, термостабильность гемагглютининов, отношение к ингибирующему действию муцина овцы и патогенность для мышей при интраназальном заражении. Другая группа включала отношение к ингибирующему действию овомуцина, патогенность для куриных эмбрионов и нейропатогенность для мышей.
--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--