Реферат: Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експеріменті
Завдання дослідження:
1. Вивчити ступінь розвитку апоптотичних процесів біохімічно за ДНК-фрагментацією в порівнянні з морфологічною детекцією при використанні ядерного барвника Хехст у тканині міокарда при антрацикліновій моделі гострої серцевої недостатності (ГСН) і за умов активації ОР.
2. Визначити особливості оксид азоту–залежного механізму активації апоптозу в тканині міокарда за рівнем стабільних метаболітів оксиду азоту – нітрит- і нітрат-аніонів та вплив активації периферичних ОР на їх вміст.
3. Встановити роль ОР у регуляції К+ АТФ –каналів плазматичної й мітохондріальної мембран кардіоміоцитів за умов стимульованого апоптозу.
4. Дати характеристику реактивності прооксидантно-антиоксидантної системи міокарда за умов активації периферичних ОР при стимуляції клітинної загибелі.
5. Вивчити стан сфінгомієлінового метаболічного шляху в кардіоміоцитах при стимуляції апоптозу й на тлі активації периферичних ОР.
6. На основі даних ядерно-магнітно-резонансної (ЯМР) релаксометрії вивчити релаксаційні механізми апоптозу при розвитку експериментальної ГСН і при активації ОР.
Об’єкт дослідження – стан апоптотичного процесу в міокарді на моделі ГСН.
Предмет дослідження – реакції різноманітних шляхів регуляції апоптозу міокарда – ОР, К+ АТФ –каналів, оксиду азоту (NO), вільного сфінгозину (СФЗ).
Наукова новизна отриманих результатів. На антрацикліновій моделі ГСН встановлено внесок вивчених шляхів регуляції в розвиток апоптотичних процесів у міокарді, що дозволить поглибити знання про програмовану клітинну загибель на молекулярному рівні й встановити її роль у патогенезі СН.
Вперше виявлено, що активація ОР у міокарді за умов розвитку антрациклінової ГСН викликає антиапоптотичний ефект.
Встановлено, що блокування К+ АТФ -каналів міокарда негативно впливало на показники фрагментованої ДНК (ф-ДНК) міокарда, що в свою чергу попереджалося попередньою активацією периферичних ОР.
Розуміння ролі NO в регуляції апоптозу при цій моделі ГСН розкрило можливі шляхи його фармакологічної корекції блокаторами ендогенного NO в клінічній практиці.
Комплексне вивчення ЯМР-релаксаційних показників біологічних рідин у взаємозв’язку з рівнем апоптозу в кардіоміоцитах дозволило з’ясувати механізми порушення водного балансу організму в цілому при СН.
Отримані ЯМР-показники дали патогенетичне обґрунтування їх системному ефекту при ГСН, підвищуючи діагностичну значимість цього методу експрес-діагностики серцево-судинної патології.
Результати дослідження дозволили розвити наукові уявлення про низку біохімічних сигнальних шляхів апоптозу при серцево-судинній патології й сприятимуть розробкам терапевтичних підходів у клінічній кардіології.
Практична значимість роботи. Визначені закономірності реактивності механізмів, які модулюють апоптоз при стимуляції опіоїдної регуляції біохімічних функцій, мають суттєве значення для можливого попередження розвитку патологічних проявів у віддалений період після формування ГСН.
ЯМР-параметри тканин можуть бути використані при оцінці біохімічних змін, що протікають у міокарді при введенні препаратів з різною про- й антиапоптотичною спрямованістю.
Факт тривалої активності антиоксидантної системи й відсотка ф-ДНК у відповідь на попередню активацію ОР до формування ГСН дещо пояснює патогенез і патоморфоз останньої, що розвинулася після застосування антрациклінових антибіотиків. Результати роботи використовуються в учбовому процесі, при роботі аспірантів і наукових співробітників за методами біохімічного аналізу патологічних процесів у тканинах і клітинних культурах.
Одержані результати сприятимуть удосконаленню біохімічної корекції розладів, що формуються на тлі окисного стресу, не лише в лабораторних умовах, але й при подальших розробках і патогенетичній терапії в клініці.
Особистий внесок здобувача. Автором здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його мета й завдання, сформовано групи спостереження. Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано й відібрано методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів і структуру бази даних. Самостійно проведені біохімічні дослідження процесів стимуляції клітинної загибелі й регуляторного впливу активації ОР у сформованих групах тварин. Здобувач безпосередньо приймала участь у проведенні імунофлуоресцентного й гістологічного аналізів. Заповнена база даних, проведений статистичний аналіз та інтерпретація отриманих результатів. Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів, створення ілюстрацій та формування висновків.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені й апробовані на I-й регіональній науково-практичній конференції молодих вчених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2005 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, інтернів і молодих вчених “Проблеми захисту інтелектуальної власності в медицині та біології” (м. Луганськ, 2005 р.); II-й регіональній науково-практичній конференції молодих учених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2006 р.); 60-й ювілейній науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини”, (м. Київ, 2006 р.); IX-му Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 2006 р.); міжкафедральних засіданнях працівників кафедри медичної хімії й науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету.
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць. Серед них: 6 статей у фахових виданнях (2 – без співавторів), 3 патенти на корисну модель, 5 тез доповідей у матеріалах п’ятьох наукових конференцій.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 4 розділів основної частини (огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень), висновків і списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 7 таблицями й 34 рисунками. Повний обсяг дисертації – 110 сторінок. Список літератури 250 джерел (87 кирилицею, 163 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали й методи дослідження. Експеримент було проведено на 492 білих щурах-самцях 16–18-тижневого віку, маса яких становила 250–300 грам. При постановці експерименту ми керувалися “Загальними етичними правилами експериментів на тваринах”, ухваленими I Національним конгресом з біоетики від 20 вересня 2001 року, Київ, Україна. Протокол експерименту узгоджений з комісією з біоетики Луганського державного медичного університету.
У тварин формували ГСН шляхом введення доксорубіцину гідрохлориду (ВАТ “Київмедпрепарат”, м. Київ) у дозі 20 мг/кг у вигляді 2 % водного розчину одноразово інтраперітонеально. Контрольним щурам вводили відповідний об’єм 0,9 % ізотонічного розчину натрію хлориду. Тварин спостерігали до сьомої доби експерименту включно.
Даларгін (синтетичний лей-енкефалін, D-Ala2 -Leu5 -Arg6 -енкефалін) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) вводили інтраперітонеально в дозі 100 мкг/кг маси щурів у вигляді 0,1 % водного розчину за 20 хвилин до формування ГСН протягом усіх діб її розвитку. Ін'єкцію налоксону (антагоніст ОР) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) у дозі 0,5 мг/кг у вигляді 0,04 % водного розчину вводили інтраперітонеально за 20 хвилин до введення даларгіну й протягом періоду спостереження, одноразово.
Неселективне інгібування АТФ-чутливих К+ АТФ -каналів викликали ін'єкцією глібенкламіду (ТОВ “Фармацевтична компанія “ЗДОРОВ’Я”, м. Харків) у дозі 0,3 мг/кг у вигляді 0,05 % водного розчину за 20 хвилин до введення даларгіну протягом усього періоду спостереження.
У кожній експериментальній групі тварин проводили морфологічну детекцію апоптозу кардіоміоцитів за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342, який зв’язується з ДНК; імунофлуоресцентний аналіз (МТТ-аналіз) і кількісне визначення генетичних маркерів апоптозу р53, Bcl-2 в тканині міокарда; у тій же тканині методом фотометрії визначали відсоток ф-ДНК (Messmer U.K., 1996), активність супероксиддисмутази (СОД) і вміст вільного СФЗ (модифікований метод Прохорової М.І., 1982); рівень NO в тканині міокарда й сироватці крові за концентрацією NO2 - й NO3 - (Орлова Е.А., 2001); час релаксації протонів води тих же тканин за даними ЯМР-релаксометра "Mіnіspec pc 100" фірми "Bruker" (Німеччина), укомплектованого модульними програмами: EDM 110A; EDM 510A; 511A; 610A; 612A; 613A, що дозволяють змінювати послідовність імпульсів; загальну оксидантну активність (ЗОА) і загальну антиоксидантну активність (ЗАА) сироватки.