Реферат: Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)

Очевидно, что именно с этим модифицированным нуклеотидом следует связать радиоактивную метку, чтобы локализовать определенный им отрезок ДНК на рентгеновской пленке после ауторадиографии. Но что же это за модификация? В какой части нуклеотида она может иметь место? Очевидно, что не в самом нуклеиновом основании. Ведь для того, чтобы быть «узнанным» ДНК-полимеразой и комплементарно включенным в растущую цепь ДНК-копии нуклеотид должен «сохранить свое лицо». Значит модификация должна коснуться дезоксирибозы. Тем более, что именно она участвует в построении сахаро-фосфатной связи между нуклеотидами, то есть в самом процессе наращивания полинуклеотидной цепочки.

Обратимся к рисункам 24, 25 и 26 на стр. 34 и 35. Рассматривая их, нетрудно вспомнить, что связь между соседними нуклеотидами образуется за счет ферментативного отщепления воды от ОН-группы, которой заканчивается остаток фосфорной кислоты в одном нуклеотиде (этот остаток присоединен в 5'-положении «своей» дизоксирибозы) и ОН-группы, присоединенной в 3'-положении к дезоксирибозе его партнера по связи. Между этими двумя положениями и устанавливается фосфорнодиэфирная связь.

Сама дезоксирибоза, как видно из сравнения двух Сахаров на рис. 24, получила свое наименование в связи с тем, что у нее на одну ОН-группу меньше, чем у рибозы. Если для получения нужного нам модифицированного нуклеотида использовать сахар, у которого вместо ОН-группы в 3'-положении стоит просто Н, то такой сахар можно назвать «дидезоксирибозой», и полное название соответствующего ему нуклеотида будет «дидезоксирибонуклеотид». Когда ДНК-полимераза включит в синтезируемую нить ДНК, в соответствии с условием комплементарности, дидезоксирибонуклеотид (а она это сделает «не заметив» подмены), то дальнейшее наращивание нити ДНК-копии прекратится, так как не будет одной из двух ОН-групп, участвующих в образовании сахаро-фосфатной связи.

Описанную процедуру авторы метода сумели повторить и с остальными тремя дидезоксирибонуклеотидами. После чего провели электрофорез продуктов четырех реакций в четырех параллельных треках ПААГ и совокупный анализ результатов разделения как в методе Максама и Гилберта. Первое время оба метода были равноправны. В методе Сенджера и сотр. было то преимущество, что он допускал большую загрузку геля при электрофорезе так как в нем нет невидимых отщепленных «хвостов» ДНК, загружающих полосы меченых отрезков такой же длины. С другой стороны, недостатком метода была необходимость посадки прай-мера на начало копируемой ДНК, от которого только и могла начать работать ДНК-полимераза I. Праймер нетрудно было синтезировать искусственно, но для этого надо было уже знать некоторую начальную последовательность нуклеотидов в секвенируемом фрагменте ДНК. Разумеется, сам праймер входил в состав всех отрезков ДНК, разделенных электрофорезом. Но если он был точно комплементарен началу матрицы, то это не мешало ее полному секвенированию. Само секвенирование начиналось с первого нуклеотида после праймера. Заметим на всякий случай, что выяснив последовательность нуклеотидов в синтезируемой нити ДНК мы узнаем, в силу комплементарности, последовательность и в самой исходной нити ДНК.

Что же касается трудности однозначного прочтения последовательности ДНК на основе совокупного рассмотрения полос в четырех треках, то она в методе Сенджера оставалась такой же, как зв методе Максама и Гилберта. Однако метод Сенджера и сотр. открыл перспективу автоматизации трудоемкого процесса секвенирования ДНК, и этим был совершен скачок в развитии молекулярной биологии.

Автоматическое секвенирование (принцип)

Переход к автоматическому секвенированию требовал в первую очередь проведения электрофореза всех четырех семейств отрезков ДНК в одном треке. Как уже отмечалось, установление относительного расположения четырех полос, расположенных в разных треках и отличающихся по длине всего на один нуклеотид, затруднительно. Логика визуальной оценки ситуации человеком может ввести коррективы в указанную ранее возможность неодинаковости условий разделения в разных треках. Наверное, этой логике можно « обучить « и компьютер, но это сильно усложнит его программу и ее надежность трудно предсказать.

Между тем в обоих методах переход к электрофорезу в одном треке с использованием радиоактивной метки невозможен. Для идентификации значения каждой полосы потребовалось бы четыре различных радиоактивных изотопа. Допустим, что это были бы доступные для биологических применений ^^ ¹⁴ C, ^S и ³² ?. Различие этих изотопов может проявить себя только в степени почернения рентгеновской пленки. Но, во-первых, энергия р-излучения двух из этих изотопов (^С и ^S) почти одинаковы, а, во-вторых, степень почернения будет зависеть еще от одного, вовсе неизвестного фактора — количества отрезков ДНК, оказавшихся случайно одинаковыми по длине и потому суммирующих свое излучение в одной полосе. (Не забудем, что исходно для секвенирования мы имеем не один, а великое множество одинаковых фрагментов ДНК, независимо друг от друга копируемых в условиях случайных обрывов этого процесса.)

Разрешение проблемы было найдено использованием для идентификации полос в геле флюоресценции вместо радиоактивности. На основе дихлорородамина были разработаны четыре флюоресцентных красителя разных цветов, с максимами излучения при 544, 569, 597 и 622 тц, лежащими в зеленой, желто-зеленой, оранжевой и красной областях спектра и легко разделимыми в спектрофотометре. Авторам удалось связать эти красители с четырьмя дидезоксирибонуклетидами. Таким образом при лазерном облучении геля каждая полоса в методе Сенджера при электрофорезе в одном треке заявляла о своей специфичности соответствующим цветом излучения.

Разумеется, каждая полоса в геле, в силу своей конечной ширины и некой кривой распределения вещества по этой ширине, испускала свет флюоресценции тоже в виде некоего колоколообразного пика интенсивности света, растянутого в направлении электрофореза. В нижних своих частях эти пики могли перекрываться (как перекрывались своими границами и соответствующие полосы в геле). Но вершины пиков хорошо отделялись друг от друга, и это позволяло прямо по этим вершинам определять порядковый номер каждого нуклеотида. А его индивидуальность — по цвету пика.

Практические аспекты автоматического секвенирования

Первый вопрос, требующий прояснения — как быть с синтезом праймера, если начало секвенируемого фрагмента ДНК неизвестно. Ответа может быть два. Первый (тривиальный) — каким-то другим способом определить начальную последовательность секвенируемой ДНК. Второй — присоединить к этой ДНК, перед ее началом, с помощью естественной сахаро-фосфатной связи другую короткую, но хорошо известную последовательность нуклео-тидов. Синтезировать праймер по ней, на нее же его посадить и таким образом заставить ДНК-полимеразу считывать интересующую нас матрицу с первого нуклеотида. Оба варианта решения проблемы можно найти в уже знакомом нам материале:

1. Выяснение начальной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК

а) Если о нем ничего неизвестно, то можно воспользоваться «устаревшим» методом Максама и Гилберта, который для первых десятков нуклеотидов достаточно быстро дает вполне надежные сведения.

б) В случае, если нас интересует секвенирование определенного гена, направляющего биосинтез вполне конкретного белка известной структуры, и если есть основание полагать, что этот ген (или хотя бы его начало) входит в состав обследуемого фрагмента ДНК. А значит и такой же длины начальную последовательность дезоксирибонуклеотидов соответствующего гена. Синтезированный праймер в этом случае просто воспроизведет расшифрованную часть иРНК.

2. Присоединение к началу секвенируемого фрагмента известной последовательности ДНК для синтеза праймера по ней.

Эту операцию мы уже, по существу говоря, проделывали, когда рассматривали возможность встраивания фрагментов чужеродной ДНК, длиною в тысячи нуклеотидов, в плазмиды. Полная последовательность нуклеотидов для множества плазмид (находящихся в продаже) хорошо известна. Таким образом мы можем естественным образом связать начало (и конец) секвенируемого фрагмента ДНК с известной последовательностью нуклеотидов плазмиды.

Встает вопрос: как узнать точно в какое место плазмиды включился наш фрагмент и как его потом «вырезать» обратно вместе с известным, ему предшествующим куском плазмиды — достаточным по своим размерам для посадки на него надежного праймера? Для ответа на этот вопрос следует вспомнить о существовании (и доступности на рынке) плазмид с «поликлоновым сайтом», насчитывающим несколько десятков пар оснований, искусственно синтезированном так, чтобы содержать в себе «сайты узнавания» для многих рестриктаз.

Для решения нашей задачи надо подобрать две рестриктазы, сайты узнавания которых в пределах поликлонового сайта отстояли бы друг от друга достаточно далеко, на расстояние, большее, чем длина будущего праймера секвенирования. Одна рестриктаза, сайт узнавания которой находился бы в «конце» поликлонового сайта (если мы определились с направлением будущего секвенирования), должна послужить для встраивания подлежащего секвенированию фрагмента ДНК. Вторая — для его последующего вырезания из плазмиды вместе с участком поликлонового сайта разделявшим сайты узнавания обеих рестриктаз. Вся последовательность нуклеотидов на этом участке известна и потому синтезировать комплементарный к нему праймер не представит труда.

Последующее секвенирование таким образом удлиненного фрагмента нашей ДНК либо начнется с его первого нуклеотида, либо с нескольких предшествующих нуклеотидов, относящихся к копированию присоединенного участка поликлонового сайта. Эти нуклеотиды легко узнать и отделить от последовательности самого исследуемого фрагмента ДНК.

Естественно, что ввиду такой определенности ситуации, фирмы-поставщики плазмид с поликлоновыми сайтами предлагают и готовые праймеры (обычно 18-членные), которые они вправе называть «универсальными», ибо они пригодны для секвенирования любых фрагментов ДНК, таким образом подготовленных.

В последнее время для умножения количества секвенируемой ДНК клонированием и создания места посадки праймера стали широко использовать бактериофаг М13. Это — нитевидный фаг, содержащий однонитевую, полностью расшифрованную ДНК. В нее, с помощью рестриктаз, точно так же, как в плазмиду можно встроить чужеродную ДНК. Попадая в клетку E.coli этот фаг приобретает двунитевую структуру и таким образом размножается в клетке («репликативная форма») до более чем 100 копий. Во время деления клетки продолжает размножаться и фаговая ДНК. Но одновременно с этим клетка E.coli (не погибая!) выбрасывает в питательную среду готовые фаговые частицы опять в виде однонитевой ДНК, одетой белком. После удаления E.coli центрифугированием, свободные фаги обрабатывают фенолом и получают однонитевую ДНК фага вместе с изначально встроенным в нее фрагментом чужеродной ДНК. Разобравшись таким образом с проблемой праймера, займемся другими важными практическими аспектами секвенирования ДНК.

Во-первых отметим, что в процессе секвенирования матричная ДНК должна все время оставаться строго однонитевой, без возможных «шпилек» — локальных двунитевых участков, образующихся в силу наличия в этой ДНК близко расположенных, пусть небольших, но комплементарных последовательностей. То же самое относится и к меченым отрезкам ДНК в процессе их разделения электрофорезом. Как мы увидим ниже, в процессе комплементарного синтеза по методу Сэнджера (он повторяется многократно — в несколько циклов) такая опасность не возникает, так как в каждом цикле имеется стадия предварительной полной денатурации при температуре 96°С, а само копирование осуществляется при температуре 60°С. Но электрофорез приходится проводить в сильно денатурирующей среде: 80% -ном растворе формамида, содержащим 5 mM раствор ЭДТА Во-вторых, следует озаботиться тем, чтобы при электрофорезе количество флюоресцентно меченого материала в каждой полосе (даже такой, в которой содержится наименьшее число отрезков ДНК) было достаточным для надежной регистрации. Вместе с тем, этого желательно добиться без чрезмерного расходования исходного материала ДНК, который обычно дефицитен.

Поэтому реакцию ограниченного (включением дидезоксирибонуклеотида) матричного синтеза на том реальном количестве секвенируемой ДНК, которое направляется в эксперимент, повторяют многократно. Это делается точно так же, как в рассмотренной ранее симметричной ПЦР-реакции. Но с тем отличием, что используется только один, начальный праймер («асимметричная ПЦР-реакция»). Этап элонгации заканчивается по достижении конца матрицы (если он не был остановлен раньше). Комплементарный синтез от второго праймера в обратном направлении здесь не фигурирует.

Подобно тому, как это описано в главе 6, здесь готовят 20 мкл инкубационной смеси, в которой содержится: одно или двуните-вая нить ДНК секвенируемого фрагмента (в последнем случае будет копироваться только одна из нитей — та, для которой синтезирован праймер), избыточное количество 4-х нормальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ограниченное количество 4-х флюоресцентных дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, термостабильная Taq ДНК-полимераза и в достаточном количестве синтетический праймер (все это в буфере с MgClg). Инкубационная смесь прогревается предварительно в тонкостенной полипропиленовой пробирочке емкостью в 0,2 или 0,5 мл при 96 °С для полной денатурации ДНК. Затем ее помещают во встроенный в прибор термоблок, где автоматически осуществляется 25 последовательных циклов, каждый из которых состоит из следующих, очень быстро сменяющих друг друга термических экспозиций:

— 10 секунд при 96 °С,

— 5 секунд при 50 °С,