Реферат: Состав мембран
Гликосфинголипиды мембран эритроцитов несут антигены группы крови. В клетках аденокарциномы человека накапливаются необычные фукозилированные гликосфинголипиды, которые можно использовать для обнаружения этих клеток и контроля за развитием опухоли.
Стеролы
Эти липиды присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. По-видимому, самым распространенным из сте-ролов является холестерол. Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой является гидро-ксильная группа. Холестерол содержится в плазматических мембранах животных клеток, в лизосомах, эндосомах и в мембранах аппарата Гольджи. Он составляет около 30% всей массы мембранных липидов во многих плазматических мембранах животных клеток. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. Растительные стеролы часто имеют еще одну боковую цепь в положении С-24 и/или двойную связь в положении С-22. В мембранах дрожжей и дру-
гих эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол. К классу стеролоподобных липидов относят также гопанои-ды, которые найдены в бактериях и некоторых растениях.
Минорные компоненты
В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые можно отнести к разряду минорных компонентов вследствие их малого содержания в мембранах. Так, в мембранах обычно обнаруживаются, хотя и в очень малых количествах, свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Пожалуй, исключением из этого правила являются мембраны хромаффинных гранул, которые, как известно, содержат необычно много свободных жирных кислот. Минорными компонентами мембран являются также моноацил- и диацилглице-ролы. Диацилглицеролы выполняют важную функцию вторых посредников в передаче сигнала при активации клеток рядом биологически активных веществ. Эта система клеточного отклика на внешний стимул будет детально рассмотрена в гл. 9. В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды. К ним относятся уби-хиноны и менахиноны — компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Можно отметить также ундекапренол и долихол, которые являются липидными переносчиками промежуточных продуктов соответственно при биосинтезе клеточной стенки у прокариот и при биосинтезе гликопротеинов в аппарате Гольджи эукариот. Длина молекул этих липидов в вытянутом состоянии значительно превышает толщину бислоя, поэтому неизвестно, как эти молекулы в нем расположены. Неясно также, почему липидными переносчиками служат именно полиизопреноидные структуры.
2. МНОГООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ
Совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако удовлетворительного объяснения этому феномену не найдено. Любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембрана имеет уникальный липидный состав? Пути биосинтеза мембранных липидов и механизмы их доставки к местам назначения обсуждаются в разд. 10.4. Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия неясны. Рассмотрим некоторые факторы, возможно, определяющие липидный состав мембраны.
1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образовать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки.
2.Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны.
3.Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль производных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот.
4.Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Например, в клетках Е. coliфосфатидилглицерол поставляет глицерофосфатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосахари-дов.
5.Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. Этот вопрос рассматривается в гл. 6.
6.Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию.
Как было показано экспериментально, организмы часто могут выдерживать — причем без всяких последствий — существенные изменения липидного состава мембран. Например, с помощью генетической трансформации можно получить штаммы Е. coli, в мембранах которых содержится 34% фосфатидной кислоты, обычно отсутствующей в штаммах дикого типа. Очевидно, тот липидный состав, который характерен для штаммов дикого типа, не является обязательным для выживания клеток, по крайней мере, в условиях их выращивания в лаборатории.
3. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
Как видно из табл. 1.3 и 1.4, мембраны содержат от 20 до 80% белка. Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. К ним относятся разнообразные ферменты, транспортные белки, рецепторы, каналы, поры и т. д., которые обеспечивают уникальность функций каждой мембраны. Первые успехи в изучении мембранных белков были достигнуты тогда, когда биохимики научились использовать детергенты для выделения мембранных белков в функционально активной форме. Это были работы по изучению ферментных комплексов внутренней мембраны митохондрий. Значительным шагом вперед было осознание того, что мембранные белки имеют не исключительно /3-складчатую структуру, как предполагалось в модели «элементарной мембраны» Дэвсона—Даниелли—Робертсона, а содержат достаточно много а-спиралей. Важное значение имел также вывод о том, что мембранные белки могут глубоко проникать в липидный бислой или даже пронизывать его и что их стабилизация осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий. Эти термодинамические представления существенно обогатили принцип «гидрофобных сил», предложенный для объяснения структуры белков и предполагавший существование неполярной, гидрофобной области внутри белковой глобулы и полярных, гидрофильных участков, контактирующих с водной средой.
По мере совершенствования методов очистки удавалось получать в изолированном виде все большее число мембранных белков. Определение первичной структуры большинства из них было затруднено из-за плохой растворимости в воде как самих белков, так и получаемых из них гидрофобных пептидов. В середине 1970-х гг. эта проблема была решена для двух мембранных белков — гликофорина и цитохрома bs, что позволило установить основной принцип структурной организации интегральных белков. В аминокислотной последовательности гликофорина — сиалогликопротеина из мембраны эритроцитов — был обнаружен короткий участок, состоящий из 23 неполярных аминокислот и расположенный примерно в середине цепи. Данные топологических и других исследований показали, что молекула гликофорина полностью пронизывает мембрану, причем погруженный в мембрану гидрофобный участок имеет а-спиральную конфигурацию. Так вошла в жизнь новая, теперь уже общепризнанная концепция о наличии в мембранных белках а-спиральных доменов, пронизывающих мембрану. Эта концепция была полностью подтверждена при изучении трансмембранных белков с помощью методов, которые позволяют получить максимально возможное в наше время разрешение. Судя по результатам реконструкции электронно-микроскопических изображений препаратов бактериородопсина из пурпурной мембраны Halobacteriumhalobiumи по данным рентгеноструктурного исследования фотосинтетических реакционных центров бактерий, эти белки содержат несколько а-спиральных участков, последовательно пересекающих бнслой.
Другой вариант расположения полипептидной цепи в мембране был обнаружен при изучении аминокислотной последовательности интактной формы микросомного цитохрома bi. Было показано, что этот белок содержит относительно короткий участок вблизи карбоксильного конца, состоящий из гидрофобных аминокислот. Этот «гидрофобный якорь» можно было удалить с помощью протеолиза, причем гемсвязывающий домен высвобождался в водорастворимой форме. Локализованный в мембране гидрофобный домен, или «якорь», стал еще одним характерным элементом структуры мембранных белков.
В основе современных представлений о структуре мембранных белков лежит идея о том, что их полипептидная цепь уложена так, чтобы образовалась неполярная, гидрофобная поверхность, контактирующая с неполярной областью липидного бислоя. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут вазимодействовать с полярными головками липидов на поверхности бислоя. Многие мембранные белки являются трансмембранными и пронизывают бислой. Некоторые белки, по-видимому, связаны с мембраной лишь за счет их взаимодействия с другими белками.
Мембранные белки обычно связываются с мембраной с помощью нековалентных взаимодействий — гидрофобных или электростатических сил. Однако есть мембранные белки, которые связаны с липидами ковалентно. Такие примеры пока немногочисленны, но их появляется все больше. Многие белки плазматических мембран растительных и животных клеток относятся к классу гликопротеинов. Углеводные остатки этих белков всегда находятся с наружной стороны плазматической мембраны.
Обычно мембранные белки подразделяют на наружные и внутренние. При этом критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлечения этих белков из мембраны. Периферические белки высвобождаются при промывании мембран буферными растворами с низкой ионной силой, буферными растворами с низким или, наоборот, высоким значением рН и в присутствии хелатирующих агентов, связывающих двухвалентные катионы. Как полагают, такие белки связаны с поверхностью мембраны за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными головками липидных молекул либо с молекулами других белков. Часто бывает нелегко отличить периферические мембранные белки от белков, связавшихся с мембраной в процессе ее выделения. При обработке мембранного препарата буфером с низкой ионной силой в раствор переходит около 30% белков, связанных с мембраной эритроцитов. При несколько более жесткой обработке хаотропными агентами высвобождаются периферические белки. В ряде случаев эти агенты оказывают влияние достаточно сильное, чтобы разрушить белок-белковые взаимодействия, хотя денатурации белков при этом не происходит. Действие хаотропных агентов, «нарушающих структуру воды», обусловлено главным образом ослаблением гидрофобных взаимодействий между компонентами мембраны.
Для высвобождения интегральных мембранных белков необходимо использовать детергенты или даже органические растворители. Детергенты разрушают липидный бислой и, как полагают, связываются с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с гидрофобной областью бислоя. Для того чтобы сохранить интегральные мембранные белки в растворенном монодисперсном состоянии, в растворе постоянно должны присутствовать детергенты. При удалении детергентов неизбежно происходят агрегация белков и их последующее осаждение. Дальнейшая информация о взаимодействиях между белками и детергентами, а также о структуре и свойствах мембранных белков содержится в гл. 3.
Резюме
Методы дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии сыграли историческую роль в развитии мембранологии и внесли решающий вклад в современные представления о биологических мембранах. Сегодня не вызывает сомнений, что липидный бислой образует структурную основу практически всех биологических мембран и что их функциональное многообразие основано именно на этом структурном единстве различных мембранных систем. Каждая отдельно взятая мембрана содержит большое число различающихся по своим химическим свойствам липидов. Причины этого разнообразия неясны, хотя появляется все больше данных об уникальных биологических функциях отдельных липидов. На долю белков приходится от 20 до 80% массы мембран. Многие из этих белков полностью пронизывают липидный бислой, и их удается солюбилизировать только с помощью детергентов. Другие мембранные белки, называемые периферическими, легкое извлекаются из мембраны с помощью буферных растворов с изменяющимися рН или ионной силой либо при удалении двухвалентных катионов с помощью хелатирующих агентов.
В настоящее время разработаны методы выделения и характеристики индивидуальных мембран из клеток прокариот, из животных и в меньшей степени из растительных клеток. Разделение чаще всего основано на различиях в размере и плотности мембранных частиц, содержащихся в гомогенате разрушенных клеток. Можно также использоать различия в поверхностных свойствах мембран или в их электрофоретическом поведении. Выделение и очистка мембран — первый и обязательный этап в их биохимическом исследовании.