Реферат: Создание биологического водителя ритма сердца

Майкл Розен (Michael R.Rosen), доктор медицины

По смертности сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему занимают ведущее положение в мире. Одни из самых распространенных сердечных патологий - аритмии, причинами которых могут быть различные функциональные и органические поражения миокарда (прежде всего инфаркт, ишемическая болезнь, врожденные или приобретенные пороки сердца и т.д.). В нормально работающем сердце ритмические сокращения миокарда происходят под действием импульсов, которые спонтанно зарождаются в клетках сино-атриального узла (рис.1). Иначе он называется первичным водителем ритма, или пейсмекером (англ. pacemaker - задающий ритм). От него возбуждение распространяется по предсердиям, заставляя их синхронно сокращаться и перекачивать кровь в желудочки, и доходит до атрио-вентрикулярного узла. Далее электрический импульс через пучок Гиса достигает его конечных разветвлений - волокон Пуркинье - и вызывает сокращение желудочков, вследствие чего кровь изгоняется из сердца в органы и ткани организма.

Рис.1. Схема расположения водителя ритма и проводящей системы в сердце.

Если по той или иной причине возбуждение сино-атриального узла не возникает либо не может перейти на предсердие, его роль выполняют пейсмекеры второго порядка, локализованные в предсердии или в атрио-вентрикулярном соединении. При полной поперечной блокаде, когда проведение возбуждения от предсердий к желудочкам полностью нарушено, включаются пейсмекеры, расположенные в проводящей системе желудочков. Если и этого не происходит, то прекращение кровообращения в результате остановки желудочков может привести к необратимому повреждению мозга и даже смерти.

При полном нарушении автоматизма сердца возбудимость миокарда все же сохраняется в течение некоторого времени, и тогда на помощь приходят искусственные водители ритма - кардиостимуляторы. Хотя за почти полувековое использование (первый портативный водитель сердечного ритма с батарейным питанием был разработан в 1957 г.) электронные пейсмекеры проявили себя очень хорошо, тем не менее у них есть ряд недостатков. Во-первых, они не регулируют реакцию сердечной мышцы на физические и эмоциональные нагрузки. Во-вторых, в случае, когда, например, болен ребенок, имеет значение масса кардиостимулятора и размеры его электродов, которые зачастую не соответствуют росту и развитию пациента. В-третьих, из-за локализации пейсмекерного электрода в сердце не всегда удается добиться оптимальной активации возбуждения и сокращения. В-четвертых, искусственные водители ритма периодически должны тестироваться и требуют замены батареек каждые 5-10 лет, т.е. практически повторной операции. И наконец, некоторые приборы (в том числе и медицинские - например, томографы) могут влиять на работу электронного пейсмекера.

Словом, как бы ни были хороши даже самые современные кардиостимуляторы, поиск альтернативы необходим. Одно из перспективных решений - биологический водитель ритма, который может работать неограниченное время, отвечать на физиологические команды, меняя сердечный ритм в зависимости от условий и активируя сердце с учетом специфики заболевания любого человека. Активное развитие в последнее десятилетие генной и клеточной терапии позволяет надеяться, что такой биологический пейсмекер будет создан и в кардиологии появится новый способ лечения аритмий [1].

Во всех исследованиях по созданию биологических пейсмекеров применялись два подхода: введение специфических генов в составе плазмидных или вирусных векторов и использование различных типов стволовых клеток. При планировании работ принимались во внимание следующие характеристики сино-атриального узла:

- слагающие его клетки специализированы, т.е. предназначены для инициации сердечных сокращений [2];

- спонтанная генерация импульсов соответствует физиологическим и эмоциональным потребностями организма, что обусловлено взаимодействием ионных каналов и насосов [3];

- распространение импульсов должно быть оптимальным для активации сокращения.

При разработке стратегии исследований учитывалось, что формирование спонтанных импульсов в сино-атриальном узле происходит в результате активации специального тока If, каналы которого открыты более сотни миллисекунд, а изменение этого тока во времени хорошо подстраивает ритм сердца [4, 5]. В пейсмекерный ток вносят вклад и входящие (например, INa), и выходящие (IK) токи, а также их взаимодействие, при котором увеличение входящего тока и/или уменьшение выходящего приводит к учащению ритма сердца [3, 6-10].

Генная терапия

Влияние на автоматизм сердца симпатической нервной системы, которое опосредовано действием ее медиаторов (адреналина и норадреналина), хорошо изучено. В связи с этим первые работы по созданию биологических пейсмекеров были направлены на активацию b-адренорецепторов, что приводит к фосфорилированию мембранных белков и усилению входящих токов. Исследователи надеялись добиться повышения автоматизма сердца в результате введения в предсердие свиньи специально сконструированного плазмидного вектора с геном, кодирующим 2-адренорецептор [11, 12]. Действительно, ритм предсердий стал достоверно выше исходного уровня. Казалось, путь к успеху проложен, однако эффект длился всего около 24 ч, и не было уверенности, что, продолжая исследования в этом направлении, можно добиться устойчивой работы водителя ритма. Неясно было даже, что в данном случае произошло - коррекция существующей пейсмекерной активности или формирование новой.

Следующим шагом стали эксперименты, в которых попытались воздействовать на выходящий, гиперполяризующий ток IK [13, 14]. Для этих целей использовали аденовирусный вектор со встроенным мутантным геном Kir 2.1, кодирующим одну из белковых субъединиц калиевого канала [13]. Эту генную конструкцию вводили в полость левого желудочка морской свинки, что привело спустя 3-4 дня к подавлению калиевого тока IK на 80%. В течение этого времени спонтанный ритм регистрировался на электрокардиограмме, и потенциалы действия кардиомиоцитов выявили его высокий уровень. Главный недостаток такого подхода заключается в том, что подавление тока IK само по себе могло стать причиной аритмии. К тому же неясно, какой из входящих токов обеспечивал пейсмекерную функцию сердца в данном случае, поэтому последствия таких работ непредсказуемы [15].

Стратегия экспериментов, проведенных в нашей лаборатории, была направлена на повышение интенсивности пейсмекерного тока If (или тока автоматизма), который в норме генерируется только в клетках сино-атриального узла. Этот смешанный ток (формируется как ионами натрия, так и ионами калия) уникален по своей природе, так как это единственный ток, который не увеличивает длительности потенциала действия и регулируется автономной нервной системой [16, 17]. Известно также, что каналы, пропускающие If, состоят из белков семейства HCN (Hyperpolarization activated, Сyclic Nucleotide gated - активируются гиперполяризацией, а состояние ворот - открытие и закрытие - зависит от циклических нуклеотидов). Ген НСN2 встроили в аденовирусный вектор и ввели в клеточную культуру, что привело не только к повышению If, но и значительному увеличению количества бьющихся клеток [18]. Более того, при воздействии на них изопротеренолом (синтетическим аналогом катехоламинов) эти клетки отвечали положительным хронотропным эффектом (ускорением сердечного ритма) и отрицательным хронотропным эффектом на ацетилхолин, как обычно и происходит в здоровом организме. Значит, эти клетки потенциально способны отвечать на физиологические команды [19].

Эксперименты продолжили на собаках, которым с помощью катетера вводили в левое предсердие аденовирусную конструкцию - AdHCN2 и AdGFP (GFP - green fluorescent protein - зеленый флуоресцирующий белок, ген которого используется для синтеза цветной “метки”). Затем стимуляцией блуждающего нерва (под наркозом) добились угнетения синусового ритма. Спустя четыре дня в области инъекции аденовируса возник новый ритм, чего не происходило у контрольных животных, которым вводили только AdGFP или физиологический раствор [20]. Более того, в дезагрегированных клетках сердечной мышцы, полученных из места инъекции, выявлен пейсмекерный ток в 100 раз большей плотности по сравнению с нативными кардиомиоцитами.

Повторное введение AdHCN2 в желудочковую проводящую систему тех же собак спустя четыре-семь дней при угнетении синусового ритма приводила к появлению в месте инъекции устойчивого ускользающего ритма - около 60 ударов в минуту, более частого по сравнению с контролем (рис.2) [21]. Повышенная экспрессия HCN2 подтверждена с помощью иммунохимических и биофизических методов [22].

Рис.2. ЭКГ собак, которым вводили аденовирусные конструкции с геном GFP (верхняя запись) и генами GFP и HCN2 [21].

До инъекции синусовый ритм у обеих собак был примерно одинаков. После его угнетения, что было вызвано стимуляцией блуждающего нерва (время стимуляции отмечено стрелками), возникал идиовентрикулярный ритм, причем у животного, которому вводили оба гена, он был учащенным и возникал быстрее по сравнению с контролем. На увеличенных фрагментах записей видно, что в первом случае (AdGFP + AdHCN2) возбуждение зарождается в левом желудочке, а во втором (AdGFP) - в правом.

Безусловно, из всех перечисленных подходов генной терапии обнадеживают только результаты последнего, поскольку только в этом случае возникал стабильно ускользающий идиовентрикулярный (собственно желудочковый) ритм приемлемого физиологического уровня и получены доказательства ответов вызванного ритма на активацию автономных нервов и их медиаторов. И все же выбранная стратегия вызывает некоторые сомнения, так как после прекращения синусового ритма и до появления идиовентрикулярного проходит от 5 до 30 с, что с клинической точки зрения недопустимо. Неясно также, удастся ли с помощью инъекции аденовирусной конструкции добиться продолжительной активности или она будет сохраняться лишь дни или недели. Сомнения вызваны кратковременной экспрессией гена, что связано со свойствами аденовируса, в который его встраивают. Дело в том, что в ядре клетки-мишени геном аденовируса существует преимущественно в эписомальной форме, т.е. в виде кольцевых внехромосомных молекул, которые в каждом цикле деления подвергаются репликации с помощью ДНК-полимеразы клетки. Вирусная ДНК может встраиваться в линейной форме в геном инфицированной клетки, тем не менее число эписомальных копий вирусной ДНК будет значительно больше, чем интегрированных, что активизирует иммунную систему и приведет к возвращению преобразованной клетки в исходное состояние. Кроме того, аденовирусы - причина обычной простуды, поэтому, возможно, некоторые люди будут уже иметь достаточно высокие уровни антител к аденовирусному капсиду (покрывающему белку), что затруднит попадание AdHCN2 в клетку. Другие вирусные векторы, например, РНК-содержащие ретровирусы, хотя и обладают некоторыми преимуществами (эффективностью передачи, геномной интеграцией, стойкой экспрессией) потенциально патогенны, поскольку обладают онкогенными последовательностями.

Клеточная терапия

Открытие способности эмбриональных стволовых клеток трансформироваться по меньшей мере в 350 различных типов клеток послужило толчком к активному их изучению и открыло перспективы их использования в биологии и медицине, в том числе и кардиологии. Однако предстояло научиться идентифицировать и выделять клетки-предшественники, которые после дифференцировки могут стать клетками необходимой линии. Опубликованные в 1999 г. в “Science” результаты экспериментов Д.Томсона и Дж.Беккера, которым удалось выделить человеческие эмбриональные стволовые клетки и получить первые линии специализированных клеток, были признаны третьим по важности событием (после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома человека) в биологии ушедшего столетия.

Когда выяснилось, что определенные подтипы эмбриональных стволовых клеток генерируют импульсы, сходные со спонтанными импульсами истинных водителей ритма, попытались использовать эти клетки в качестве биологических пейсмекеров [22]. Но и здесь возникло немало проблем.

Во-первых, поскольку незрелые эмбриональные стволовые клетки после прекращения дифференцировки могут утратить пейсмекерные характеристики, было бы большим достижением, если бы удалось останавить развитие полученных кардиомиоцитов на стадии сино-атриальных клеток.

Во-вторых, важно выяснить, какие каналы определяют спонтанный ритм пересаженных клеток, и убедиться, что это именно те каналы, которые обеспечивают работу истинных водителей ритма в сердце человека. Кроме того, надо знать, как созданная конструкция будет отвечать на стимуляцию вегетативных нервов, т.е. определить чувствительность новых кардиомиоцитов к автономным нервным воздействиям. Эти вопросы возникли в связи с потенциальной аритмогенностью создаваемых водителей ритма [23]. Ответив на эти вопросы, можно понять: развитие аритмии в данном случае - артефакт (например, следствие экспериментальных манипуляций) или потенциально опасное свойство биологических пейсмекеров, созданных на основе эмбриональных стволовых клеток. И наконец, не решена проблема иммунного ответа организма на присутствие завершивших дифференцировку клеток. В этом отношении более перспективны, на наш взгляд, мезенхимальные стволовые клетки, которые, как и эмбриональные, полипотентны (т.е. способны дифференцироваться в ряд клеточных линий, включая клетки скелетных мышц и клетки соединительной ткани), но при этом, по-видимому, обладают “иммунопривилегированностью” - на последних стадиях развития не вызывают существенного иммунного ответа [24].

Изначально стволовые клетки были обнаружены в костном мозге взрослого организма (точнее, в мезенхиме, или строме, костного мозга). Впоследствии оказалось, что они присутствуют практически во всех органах взрослых животных и человека; тем не менее обычно их выделяют из костного мозга. Таким образом, появилась заманчивая перспектива: создание банка мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии различных патологий. В случае, когда по каким-либо причинам нельзя использовать донорские стволовые клетки, их источником может служить собственный костный мозг пациента. Однако до того как это будет введено в практику, необходимо более тщательно изучить биобезопасность, в частности “иммунопривилегированность”, стволовых клеток.

Мы рассматривали мезенхимальные стволовые клетки взрослого человека в качестве основного экспериментального материала. Прежде всего нас привлекли стабильность клеточных линий и их низкая антигенность. Однако мезенхимальные стволовые клетки человека не способны генерировать пейсмекерный ток If, поэтому необходимо было нагрузить их геном HCN2, который, напомню, отвечает за трансляцию синтеза белков, формирующих и переносящих If. Сделано это было с помощью метода электропорации: клетки поместили в пульсирующее электрическое поле, благодаря чему временно открывались поры в клеточной мембране, через которые мог проникнуть вирусный переносчик со встроенным геном HCN2; при этом эффективность заражения составляла 35-45% [25].

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--