Реферат: Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение
В органических растворителях наблюдается сильное изменение структуры грамицидина при связывании с катионом , что демонстрируется изменением как формы, так и амплитуды спектра КД.
При исследовании связывания цезия с грамицидином в растворе наблюдается постепенное изменение формы спектра КД, что свидетельствет о плавном переходе из формы свободного грамицидина в ион-связанною. Эти данные были использованны для определения констант связывания цезия, которые составили К1 =170 М-1 – для первого (более крепкого )сайта, и К2 =20 М-1 – для второго (более слабого ) сайта связывания. Константа связывания для лития, определенная тем же методом имеет величину на порядок меньшую, чем таковая для цезия [28]. Константа связывания для натрия была определенны методом 23 Na ЯМР [53] и составила 4 М-1 . Константы связывания других ионов не были определенны, в связи с их низкой аффинностью, что делает такие изимерения довольно сложными.
В растворе хлороформ-метанол в присутствии тиоцианата цезия грамицидин (по данным двумерной ЯМР-спектроскопии) представляет собой правозакрученную антипараллельную двойную спираль с 7,2 остатка на виток (b7,2 -спиральный димер) и сдвигом в 1,5 остатка, что свидетельствует о том, что 1 Val не участвует в образовании водородных связей [54] (рис.6). Кристаллические структуры грамицидина дают дополнительную информацию о его трехмерной структуре и, более того, возможность формирования кристаллов в отсутствии и в присутствии ионов позволяют изучить их влияние. Обе ионсвязанная и ионсвободная кристаллические структуры грамицидина являются левозакрученными антипараллельными двойными спиралями и отличаются от форм в растворе значениями углов f и y, направлением образования водородных связей и регулярностью укладки полипептидного остова. Ионсвободная кристаллическая форма длиннее (31 Ǻ) и уже (внутренняя полость довольно узкая и в некоторых местах не способна связывать ион) чем кристаллическая форма с тиоцианатом цезия (26 Ǻ в длину , 4,9 Ǻ – внутренний диаметр поры, в которой помещается ион цезия) [17].
А Б
.Рисунок 6.
СРК Изображение правозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 7,2 остатка на виток (ββ7,2 -двухспиральный димер) (PDB Code: 1AV2) в компелексе с цезием. А – вид сверху и ион цезия; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами (красный и синий).
Конформация полипептидного остова в ион-связанной форме грамицидина более упорядоченна, хотя и имеются некоторые вариации углов f и y в районах прилегающих к сайтам связывания катионов, а водородные связи направленны почти параллельно оси спрали [55]. Это говорит о том что данная спираль с большей вероятностью имее 6,4 остатка на виток, чем 7,2 .
Сравнение ион-свободных и ион-связанных форм грамицидина показало, что при связывании происходит переупаковка и адаптация трехмерной структуры под конкретный катион. Такая перестройка возможна при реорганизации водородных связей. Так же наблюдается локальное расширение спирали в местах связывания иона и реориентация карбонильных групп пептидного остова, участвующих в связывании ионов [17].
2.6.Локализация сайтов связывания катионов в различных конформациях грамицидина
Катион связывающие сайты в двухцепочечных структурах могут быть определенны непосредственно из их кристаллических структур в комплексе с хлоридом цезия [56]. Внутри поры находятся два иона цезия симметрично расположенных на растоянии ~7,2 Ǻ от конца спирали. Сайты связывания сформированны карбонильными группами полипептидного остова, которые, связывая ион ориентируются к оси спирали под углом ~40º. Угловое перераспределение карбонильных групп увеличивает дистанции между группами, образующими водородные связи, и таким образом изменяются значения углов f и ψ. Карбонильные группы на противоположных сторонах поры, пренадлежащие остаткам 11 Trp и 14 Leu, являются ближайшими к связанному катиону. В таких кристаллах помимо двух ионов цезия в комплексе с грамицидином так же находятся еще и три иона хлора, два из которых расположенны на противоположных концах спирали, а третий - в её центральной части. Ионы хлора отделены от цезия молекулами растворителя на растояние ~10 Ǻ. Наличие связанных ионов хлора довольно необычно, так как грамицидин не транспортирует анионы, а теоретические расчеты [57] показывают, что энергетический барьер связывания аниона значительно больше чем катиона (что делает вход в канал для аниона менее выгодным). Присутствие аниона внутри поры может быть вызвано высокой концентрацией соли в кристаллах и ионы хлора взаимодействуют с сайтами связывания подобно тому как это делают молекулы растворителя. В кристаллах с тиоцианатом цезия позиция иона цезия отличается от таковой в кристаллах с хлоридом цезия [55]. Исследования показали, что в этих кристаллах сайты связывания находятся ближе к концам спирали.
Наблюдение различных сайтов связывания катионов в кристаллах могут моделировать отдельные стадии транспорта катиона через грамицидиновый канал.
Потенциальные взаимодействия катионов с грамицидиновым каналом были изученны с помощью расчетов теоретических энергий и молекулярно-динамических симуляций [58], и показали важность С-концевой этаноламиновой группы для энергетического профиля канала, а точенее, для локализации энергетического минимума и динамики колебаний карбонильных групп полипептидного остова и трансмембранного транспорта катионов [59].
Замещение С-концевой этаноламиновой группы не влияет на свойства проводимости, она возможно играет роль в стабилизации некоторых конформаций грамицидиновой молекулы. При входе в канал катион постепенно обменивает свою гидратную оболочку на карбонильные группы полипептидного остова грамицидина, этаноламин (а точнее его гидроксильная группа) играет роль своеобразного посредника при таком переходе и забирает часть молекул воды гидратированного иона на себя, облегчая таким образом его вход в канал. [60].
Энергетические профили спирального и двухспирального димеров отличаются не очень сильно, за исключением величины энергетического барьера при входе в канал, и за счет этого двухспиральные каналы могут иметь меньшую проводимость чем односпиральные [17].
2.7.Взаимоотношения между конформационными состояниями грамицидина и проводящими формами
Грамицидин формирует характерные каналы при исследованиях в черных липидных мембранах. Проводимость одиночных каналов и их время жизни зависит не только от природы липида, формирующего бислой, но и от присутствующих в среде ионов. Проводимость и среднее время жизни грамицидновых каналов находятся в довольно узком диапазоне. В мембранах сформированных из глицерол-моноолеата [43] или из дифитаноилфосфатидилхолина [61] в присутствии 0,1 М NaCl средняя проводимость равна ~5 пикосименс (pS), а время жизни - ~0,5 секунд. При более высоких концентрациях соли проводимость увеличивается, а в более толстых мембранах, полученных при использовании различных растворителей, время жизни канала уменьшается при неизменной проводимости [43]. Симметрия расчитанного энергетического профиля говорит о том, что основная проводящая форма канала представляет собой структуру с центральной симметрией. Соотнося эти данные с остальными результатами можно сказать что основной проводящей структурой является спиральный димер N-конец к N-концу , хотя и нельзя полностью отрицать возможность существования активного канала антипараллельной двухцепочечной спиральной структуры, что было подтвержденно экспериментально [17]. В некоторых экспериментах при различных пропорциях липидов, используемых для формирования бислоя были обнаруженны очень долгоживущие каналы ( время жизни >100 сек.), которые были представленны в соотношении 5-10% по отношению к основной форме. Гибридные аналоги грамицидина, не способные формировать димер N-конец к N-концу, но способные образовывать двойные спирали так же обнаруживали такие же долго живущие каналы [32]. Более того кросс-сшитые аналоги (С-конец к N-концу), так же не способные образовывать димер N-конец к N-концу образовывали долгоживущие каналы в соотношении 80% к основной форме [62].
Помимо основной и долгоживущей форм каналов были обнаруженны еще и “мини” каналы сменьшей средней проводимостью и временем жизни, формирующиеся в различных пропорциях по отношению к основной форме в зависимости от условий образования бислоя [63,64]. Данные каналы предположительно имеют такую же структуру что и основная форма (спиральный димер N-конец к N-концу), но отличаются от нее другой ориентацией карбонильных групп полипептидного остова в сайтах связывания катионов [65].
Изучения синтетических аналогов грамицидина помогают определить молекулярную основу свойств природного грамицидинового канала. Одним из важных наблюдений является корреляция свойств специфической структуры с функцией. Хорошим примером такой корреляции является возможность образования гибридных каналов [66], представляющих собой димеры в которых один мономер представлен каким-либо аналогом, а второй – другим аналогом или же нативным грамицидином.
Одна доминирующая проводящая форма существует в бислоиных мембранах, которая является спиральным димером N-конец к N-концу (голова к голове). Кроме того существуют другие проводящие формы, найденные в различных пропорциях в зависимости от условий эксперимента. Некоторые из них возможно имеют конформацию двойной спирали.
2.8.Встраивание в мембрану и стабильность
В исследованиях по проводимости грамицидин может быть добавлен к сформированной мембране в качестве концентрированного спиртового раствора. При встраивании в липосомы грамицидин может быть добавленн таким же образом ( то есть добав