Однако потребовалось еще десять лет для того, чтобы методом рентгеноструктурного анализа определить его структуру, которая оказалась чрезвычайно сложной. За расшифровку структуры витамина В₁₂ (1955 г.) Дороти Ходжкин была присуждена нобелевская премия.

Витамин В₁₅ (пангамовая кислота) был впервые обнаружен в 1950-м году Томиямой в экстракте печени быка. Название пангамовой кислоты происходит от латинских корней «пан» - всюду и «гами» - семя, так как позже она была обнаружена в составе семян огромного количества растений.

Номенклатура корриноидов

Ц

Рисунок 1. Структура корриноидов.

R₁=OH – кобириновая кислота; R-NH₂; R₁=OH – кобировая кислота; R-OH; R₁-остаток 1-амино-2-пропанола – кобиновая кислота; R=NH₂; R₁-остаток 1-амино-2-пропанола – кобинамид; R=OH; R₁-остаток D-рибофуранозил-З-фосфата – кобамовая кислота; R-NH₂: R₁=остаток D-рибофуранозил-З-фосфата – кобамид

???????????? ????????? ? ?????? ??????????? - ??????????? ???????, ????????? ???????? ?????????? ?????????. ??????, ?????? ? ????????? ?? ????????, ??????? ??? ?????? ?????????? ???????? ????? ????? ????????????. ? ?? ????? ??? ???????? ???????? ??????? ?? 12 ??????????? ??????? ??????, ?????? ??????? ?? ???????? ??????????????? ?????????? (????????????) ????????????. ?????????? ?????? ???????? 6 ??????? ??????, ???????? ? ?????? ???????? ??????????? ???????, ?????????? 12 ?? 15 ??????, ???????????? ?????????? ?????? ??????????. ?????????? ?????? ?????? ?? ????????? ? ????????????. ???? ? ????????? ?????? ???? ?????????? ????? ???????? ?????????? ?????????, ?? ? ??????? ?????? ? ? D ????????? ??????????????? ?????? ????? α-???????????. ??????? ?????????? ?????? ??????????? ?????????? ???????? ?? ???? ???? ???????? ??????, ??? ????????????.

В

Рисунок 2. Нумерация атомов в молекуле цианкобаламина.

???????????? ? ????????????? ???????????, ???????????? ? 1975 ?. ????????????? ????????? ?? ????????????? ????????????, ???????????? ?????????????? ??????, ????????? ?? ??????? ??????????????? ?????????? ????? ? ?????? ???????? ? ??????, ?????? ????????, ? ?????????? ??? ?????????? - ????????????. ??????????????? ???????, ???????????? ?? ???. 1, ??????? ??????????? ????????. ????????????? ?????? ?????????? ??????? ?-g, ??? ???????? ?? ???? ???????. a,b,c,d,e,g-????????? ??????????? ??????? ?????? ????????? ????????. ????????? ??????? ???????? ?????? ??????????? ??????? ? D-1-????????????????-2 ? ????????? f; ??? ????????? ?????? ???????????. ????????? ??????? ???????? ?????????????? ??????????? ????????? ???????, ? ??????? ????????? 2 ????????? ?????????????? ??????? ???????? α-D-?????????????-?-???????; ??? ????????? ?????? ?????????. ????????, ??????? ????? 5,6-??????????????????????? ??????, ????????? ??????????? ?????? ????? N1 ? ?1 ????????????, ?????????? ????????????. ??????????, ??????? ? α-?????????? ????????? ?????? 5,6-????????????????????? ?????? ?????????, ????? ?????????? ??????????.

Химия витамина В₁₂

В

Рисунок 3. Структура цианкобаламина.

?????? B₁₂ ??????????????? ? ???? ?????-??????? ??? ??? ?????; ???? ????????? ? ??????????? ?? ???????? ??????????. ????????? ??????? ??? 210-220?, ?? ?? ???????? ??? ??????????? ???? 300⁰?. ??????? ?????????????? ??????????? ???? ?????????? ???????????, ? ?????? α = 1,616, β = 1,652, γ = 1,664. ???????????????????? ????????? ??????????, ??? ????????? ????????? ? ??????????????? ??????? ? ????? ?????????????? ?????. ??? ?????????????? ?? ??????? ???????? ? ?? ????? ???? ? ???????? ??? ???????? ????????????, ?? ?????????? ?????????? ???????? ????????? ?????????????????? ????. ?? ????? ??????? ??????????? ??? ?????????? ????????, ?????? ????????? ?? ?????? ????? ?????. ????? ????? ???????????? ???????? ????? ????? ????????? ????? ?? ???????????? ??????? ? ?????????? 10-12%; ??? ? ???? ??? ???????, ??????? ?????? ??????????? ??? ????????? ???????? B12 ? ??????????????? ? ??????????? ?????? ? ???. ??????? B12 ???????? ?????? ????????? ? ???? (????? 1,2% ??? ????????? ???????????), ? ????? ? ?????? ???????, ? ?????? ????????????? ???????? ? ? ???????, ?? ??????????? ?? ?????? ?????? ???????????? ?????????. ?? ??????????? ?? ???????????? ? ???????? ? ?????? ????????? ??????, ?? ????????? ? ????????? ?????? ??? ????????????? ??????, ???????? ? ????????? ? ????????????????. ??????? ???????? ????????????? ?????????, ?? ???????????, ??????? ?????????? ????????? ??????????? ????????. ??????? B12 ???????? ????????????? ??????????, ??? ????????? ?? ????????????? ????????? ????????.

Обычно витамин выделяют из микробной массы или животных тканей, используя растворы, содержащие цианид-ионы, играющие роль шестого лиганда кобальта. Однако сам цианкобаламин метаболически не активен. В состав ферментов входит соединение, в котором цианогруппа замещена остатком 5-дезоксиаденозина или метильным радикалом.

Строение

Признанная формула витамина B₁₂ – C₆₃H₈₈O₁₄N₁₄PCo. Молекулу можно подразделить на две основные части, известные как "планарная группа" и "нуклеотид"; вторая часть лежит в плоскости, почти перпендикулярной к плоскости первой части, которая обладает очень большим, хотя и неполным, сходством с порфиринами Центральный атом кобальта соединен с четырьмя восстановленными пиррольными кольцами, образующими макрокольцо. Три из четырех соединений между кольцами образованы мезоуглеродным атомом (углеродным мостиком), характерным для порфиринов. Однако в четвертом месте соединения существует прямая связь между двумя α-углеродными атомами колец D и А. Макрокольцо содержит 6 сопряженных двойных связей, образующих единую сопряженную систему.

У 13 из 19 углеродных атомов, составляющих макрокольцо, водород полностью замещен метильными группами или длинными боковыми цепями – либо ацетамидными, либо пропионамидными радикалами

В отличие от нуклеотидов нуклеиновых кислот так называемый нуклеотид витамина B₁₂ не содержит пурина или пиримидина. Вместо них основанием служит 5,6-диметилбензиминазол. Сахар представлен рибозой, но с α-гликозндпой связью, опять-таки в отличие от β-связи в нуклеиновых кислотах. Рибоза фосфорилирована при 3-м атоме углерода. Фосфат образует эфирную группу с 1-амино-2-пропиловым спиртом, который, кроме того, соединен амидной связью с цепью пропионовой кислоты при кольце D. Наконец, атом кобальта несет CN-группу (в цианкобаламине) и соединен координационной связью с одним из атомов азота в бензиминазоле, образуя, таким образом, второй мостик между двумя частями молекулы. Полагали, что третий гидроксил фосфатной группы тоже этерифицирован, пока не стало ясно, что неустойчивость триэфиров фосфорной кислоты исключает такую структуру. Витамин B₁₂ является по существу внутренней солью; отрицательный заряд на атоме фосфора нейтрализован положительным зарядом на координационном комплексе кобальта.

Кобаламины

Первые химические данные о витамине B₁₂ содержались в одновременных сообщениях из лаборатории Глаксо и Мерка, в которых указывалось на присутствие в его молекуле кобальта и фосфора. Самые ранние английские публикации касались второго красного фактора, появляющегося на хроматограммах наряду с витамином B12; Этот фактор был получен в кристаллическом виде Пирсом и его Сотрудниками в лаборатории Ледерле и был назван витамином B_12b. Тем временем исследователи из лабораторий Мерка описали витамин В_12а как вещество, образующееся при обработке витамина В₁₂ водородом в присутствии платинового катализатора. Позже он оказался идентичным витамину В_12b. В лабораториях Глаксо было описано еще одно родственное соединение – витамин B_12c. В 1950 г. отношения между этими "витаминами B₁₂" выяснились в результате почти одновременных сообщений из лабораторий "Органон" (Голландия) и Мерка, в которых было показано, что витамин B₁₂ содержит группу цианида, соединенную координационной связью с кобальтом. Группу цианида можно было удалить фотолизом или путем восстановления в определенных условиях с выходом витамина B_12a, который, как предполагали, содержит на месте цианида гидроксильную группу. При обработке водным раствором цианида витамин B_12a быстро превращается в тот пурпурный дицианидный комплекс, который возникает из самого витамина B₁₂. После подкисления вторая группа цианида теряется и остается витамин B₁₂. Для всей молекулы B₁₂, исключая группу цианида, был предложен термин "Кобаламин", так что витамин B₁₂ стал называться цианкобаламином, а витамин B_12a оксикобаламином. Эта терминология получила широкое признание.

Путем обработки витамина B_12a различными кислотами удалось получить ряд других аналогов. К ним относится витамин B_12c, содержащий группу азотистой кислоты; он был назван нитриткобаламином, или нитрокобаламином. По-видимому, витамин B_12a обычно существует не в форме оксикобаламина, а в форме аквокобаламина, молекула которого содержит нейтральную молекулу воды, что сообщает всему координационному комплексу основные свойства; это согласуется с данными о том, что соединение титруется как основание. Можно получить другие основные кобаламины, содержащие вместо воды молекулу аммиака или некоторых аминов. Кроме этих основных и нейтральных соединений, существует еще класс кислых кобаламинов. Из них наиболее известно пурпурное вещество, образующееся при добавлении избытка цианида, к витамину B₁₂. Оно содержит 2 молекулы цианида, соединенные координационными связями с кобальтом. Бивен и сотр. получили довольно убедительные спектроскопические данные о наличии координационной связи между свободным атомом азота в бензиминазоле и кобальтом. Избыток цианида разрывает ее, по-видимому, потому, что ион цианида образует с металлом более прочную координационную связь. Дицианосоединение, однако, устойчиво только в щелочном растворе. Дицианкобаламин легко замещает цианогруппу на ОН^-, NO₂^-, SO₃^-, Cl^-, Br^-, SCN^- и пр. Все производные в присутствии цианид-ионов превращаются в цианкобаламин.

Устойчивость и взаимопревращения различных классов Кобаламинов изучали с помощью изотопов и другими методами. Все эти вещества без исключения превращаются в витамин B₁₂ под действием цианида. Неудивительно поэтому, что все они обнаруживают биологическую активность в отношении микроорганизмов, а также животных и больных пернициозной анемией, хотя некоторые из них менее активны, чем цианкобаламин.

До сих пор мы рассматривали витамин В₁₂ как нейтральное вещество, хотя в действительности это чрезвычайно слабое основание. Это обнаружилось еще в ранних исследованиях при титровании в растворах уксусной кислоты.

Кислотный гидролиз витамина B₁₂

При обработке витамина B₁₂ неорганическими кислотами в различных условиях получено много продуктов расщепления. Одним из первых был идентифицирован аммиак, образующийся при гидролизе амидных групп. Химическое изучение концентратов антипернициозного фактора привело к предположению, что он представляет собой вещество полипептидной природы. Однако при исследовании кислотных гидролизатов обычным методом хроматографии на бумаге в чистых образцах кристаллического витамина не нашли никаких признаков наличия α-аминокислот. Тем не менее, группа исследователей из Британской палаты медицинских препаратов обнаружила на хроматограмме пятно, дающее нингидриновую реакцию^*; эта реакция была обусловлена не аминокислотой, а пропаноламином.

При взаимодействии с концентрированной HCl при 65^оС происходит отщепление нуклеотида и образование кобинамида (фактора В – см. ниже), затем происходит отщепление и образование кобировой кислоты (фактора V_1a).

Нуклеотид

При кислотном гидролизе витамина B₁₂ в жестких условиях образуется 5,6-диметилбензиминазол. Было показано, что полностью нуклеотид соответствует названию 1-α-D-рибофуранозид-5,6-диметилбензиминазол. Сомнительным оставалось только то, в каком положении - 2 или 3 - фосфорилирована рибоза. Окончательно этот вопрос был решен лишь с помощью рентгеноструктурного анализа.

Продукты мягкого кислотного гидролиза

В первом приближении, мягкий гидролиз разбавленной хлороводородной кислотой приводит к частичному дезаминированию, последовательному образованию моно-, ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гептакарбоновых кислот с сохранением нуклеотида.

Продолжительная обработка витамина B₁₂ холодной разведенной соляной кислотой приводила к медленной потере микробиологической активности, при этом интенсивность красной окраски не изменялась. Было обнаружено, что с увеличением длительности гидролиза возникает все более сложная смесь продуктов. Среди них одно-, двух-, трех- и четырехосновные кислоты, образующиеся при последовательном удалении аммиака из амидных групп. При добавлении азотистой кислоты в этих условиях образовывались также небольшие количества пяти- и шестиосновных кислот, обладающих красной окраской. Монокарбоновые кислоты можно разделить на три. Дикарбоновые кислоты также разделяются на три изомера; трикарбоновые кислоты фракционировать не удавалось. Этого и следовало ожидать при случайном гидролизе трех лабильных амидных групп. Относительные количества получаемых изомеров показывали, что одна из этих групп значительно лабильнее остальных. Три остальные амидные связи гидролизовались только при обработке кислотой в более жестких условиях или при каталитическом воздействии азотистой кислоты. Когда в результате рентгеноструктурного анализа строение витамина было выяснено, появилась возможность истолковать эти наблюдения. Три лабильные амидные группы, очевидно, принадлежат трем цепям пропионамида, а три стабильные группы - ацетамидным цепям.

Это описание продуктов кислотного гидролиза упрощено, так как, за исключением случаев самого мягкого гидролиза, при электрофорезе выявлялась еще одна группа кислот. Эти кислоты образуются в результате отщепления не только ряда молекул аммиака, но также и нуклеотида.

В водном растворе при мягком кислотном гидролизе (а также фотолитически или при каталитическом гидрировании) цианкобаламин, через промежуточную стадию В_12r (см. Восстановление витамина В₁₂) с последующим окислением кислородом воздуха переходит в оксикобаламин.

Фактор В

Исследователи из лаборатории Глаксо нашли, что молекулу витамина можно аккуратно разделить на две части кратковременным нагреванием с концентрированной соляной кислотой или, еще лучше, с хлорной кислотой. При тщательно контролируемых условиях (например, 5 мин при 65°) амидные группы почти не подвергались гидролизу и главными продуктами были, нуклеотид и неизмененная остальная часть молекулы. Последний продукт сохранял микробиологическую активность и оказался идентичным природному фактору, выделенному из содержимого рубца жвачных. В присутствии цианида растворы этого вещества имели пурпурную окраску даже при слабо кислой реакции среды. Спектр поглощения был очень сходен со спектром дицианкобаламина, так что в этом состоянии вещество почти наверное содержало два остатка цианида, соединенных координационной связью с кобальтом. Однако в то время как дицианкобаламин имел кислотные свойства, новое соединение было нейтральным. Причина такого различия состояла в отщеплении кислого нуклеотидного остатка. Это наблюдение по существу явилось главным основанием для представления о витамине B₁₂ как внутренней соли.

Ряд кислот, образующихся при гидролизе амидных групп в факторе В, обладал той же относительной стабильностью в их дициано-конфигурации.

Были получены указания на то, что существует 7-я карбоксильная группа, связанная не с аммиаком, а через амин с нуклеотидом. Это подтверждало более раннее предположение о том, что аминопропиловый спирт служит мостиком между двумя частями молекулы, будучи соединенным амидной связью с одной из цепей пропионовой кислоты в планарной группе и эфирной связью - с фосфорной кислотой. В кислых растворах (с рН примерно менее 3) фактор В теряет обе группы цианида и ведет себя как основание. Соответствующие кислоты ведут себя сходным образом, так как карбоксильные группы не подвергаются заметной ионизации. Поэтому все вещества, не содержащие нуклеотида, можно отделить от веществ, еще сохранивших его.

Щелочной гидролиз

Жесткий щелочной гидролиз приводит к отщеплению 5,6-диметилбензимидазола и образованию дилактампента- и монолактамгексакарбоновых кислот.