Реферат: Вплив біологічних флогогенних факторів на епітеліоцити піхви в експерименті
Методи дослідження: біохімічні (визначення ДК, МДА, активності каталази, супероксиддисмутази (СОД), вмісту циклічних нуклеотидів), імунологічні (визначення вмісту інтерлейкінів, кахектину (ФНП-a), гамма-інтерферону (ІФН), простагландину Е2 (ПГ), трансформуючого фактору росту (ТФР), маркерів апоптозу CD38 та CD95), мікробіологічні (виділення ПГН, ТК та ЛПС з клітинних стінок бактерій), статистичні (методи варіаційної статистики).
Наукова новизна отриманих результатів. Показана здатність епітеліоцитів піхви продукувати ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-a, ТФР, ПГЕ2 та гамма-ІФН in vitro. Встановлені рівні секреції медіаторів, активності процесів ПОЛ, ферментів системи АОЗ, вмісту циклічних нуклеотидів, а також рівні експресії рецепторів до моноклональних антитіл CD38 та CD95 епітеліоцитами піхви здорових жінок та жінок, хворих на БВ різного ступеня тяжкості. Встановлений дозо- та часозалежний вплив ТК, ПГН та ЛПС бактерій – етіологічних агентів БВ – на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок in vitro. Встановлений дозозалежний вплив бактеріальних ТК, ПГН та ЛПС на вміст у епітеліоцитах піхви продуктів ПОЛ (ДК та МДА), на активність ферментів системи АОЗ (каталази та СОД). Показаний дозозалежний та видоспецифічний вплив бактеріальних ТК, ПГН та ЛПС на внутрішньоклітинний вміст в епітеліоцитах піхви цАМФ та ЦГМФ та експресію рецепторів CD38 та CD95.
Практичне значення отриманих результатів.Отримані дані дозволяють провести моніторінгову та скринінгову оцінку біохімічного статусу епітеліоцитів піхви здорових жінок та пацієнток з БВ різного ступеня тяжкості; дозволяють проводити корекцію секреторної активності епітеліоцитів піхви, інтенсивності процесів ПОЛ, активності ферментів системи АОЗ, стану системи циклічних нуклеотидів та експресії рецепторів до антитіл CD38 та СD95 шляхом зміни концентрації та тривалості контакту клітин з флогогенними бактеріальними факторами. Отримані дані використовуються в навчальному процесі кафедр патофізіології і мікробіології Луганського державного медичного університету Мінздраву України, що підтверджено відповідними актами впровадження.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Т.О. Журби. Вибір теми наукового дослідження, постановка мети, задач і обговорення одержаних результатів, планування роботи були здійснені разом з науковим керівником професором Н.К. Казімірко. Авторкою самостійно проведений: патентно-інформаційний пошук за допомогою бази даних “Medline”, аналіз літератури за темою дисертації, виконана експериментальна частина роботи, вивчені та узагальнені результати проведених досліджень, обґрунтовані наукові висновки і рекомендації для практичного використання одержаних результатів, написані всі розділи дисертації та автореферат.
Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації оприлюднені та обговорені на засіданнях: наукової конференції “Четверті читання імені В.В. Підвисоцького” (Одеса, 2005); X міжнародного медичного конгресу студентів і молодих учених Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (Тернопіль, 2006); 101-го щорічного засідання Товариства анатомів Німеччини (Фрайбург, 2006); 23-ї сесії Товариства анатомів Німеччини (Вюрцбург, 2006); Міжміської конференції молодих вчених наукового товариства патофізіологів “Актуальні проблеми патофізіології” (Санкт-Петербург, 2007); Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, молодих вчених та інтернів “Актуальні проблеми фундаментальної медицини (англійською мовою)” (Луганськ, 2007), а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів протягом 2004-2007 рр.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 наукових статей та 5 тез в часописах та збірках, які відповідають вимогам ВАК України та надруковані згідно вимог, викладених в пункті 3 Постанови ВАК України від 15 січня 2003 р. за № 7-05/1.
Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 139 сторінках комп'ютерного набору та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 21 таблицею, 3 рисунками. Список літератури включає 138 джерел вітчизняних та іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження.Епітеліоцити одержували шляхом піхвових лаважей від 25 здорових жінок-добровольців під час профілактичних оглядів, проведених у поліклініці № 10 м. Луганська з 2005 по 2007 рр. Лаважну рідину отримували шляхом лаважей від 58 жінок віком від 19 до 45 років (середній вік – 30,7±0,33 роки), хворих на БВ. Робота виконувалась у відповідності до загальноприйнятих біоетичних норм: всі пацієнтки дали згоду на обстеження та участь у випробовуваннях, цифрові результати яких увійшли до даного дисертаційного дослідження. В піхву вводили стерильне гінекологічне дзеркало, а потім за допомогою стерильної піпетки, з’єднаної з одноразовим шприцом (об’єм – 10 мл), проводили лаваж 5 мл стерильного фосфатно-буферного розчину протягом 30 секунд. Рідину збирали в стерильну пробірку, центрифугували протягом 10 хвилин при 800 g і видаляли супернатант. Клітини, що залишилися, ресуспендували і використовували або негайно, або заморожували при -70ºС до використання. Результати були однаковими як при використанні свіжих клітин, так і епітеліоцитів, які заморожували. Чистоту пула епітеліальних клітин (>95 %) визначали шляхом підрахунку 100 клітин у 5 різних полях зору і виражали як середній відсотковий вміст клітин з характерними для епітеліоцитів морфологічними ознаками. В усіх дослідах використовували епітеліоцити піхви в концентрації (5,0±0,25)* 5 lg клітин/мл.
ПГН одержували з клітинних стінок бактерій за методом P.K. Peterson і співавт. ТК екстрагували з клітинних стінок 10 % трихлороцтовою кислотою. ЛПС одержували з культур бактерій Escherichia coli (серотип 055:B5, Sigma, Великобританія). Вивчення впливу на епітеліоцити ТК, ПГН та ЛПС проводили при їх концентрації 10,0; 50,0 і 100,0 мг/л в тест-середовищі при спільному культивуванні протягом 24, 48, 72 та 96 годин.
Вміст ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-a, гамма-ІФН, ПГЕ2 визначали в супернатантах клітин, отриманих після центрифугування (в здорових жінок) та в лаважній рідині (в пацієнток з БВ), імуноферментним методом. Вміст ТФР визначали з використанням тест-систем виробництва фірми BioSource International, США. Визначення МДА проводили за методом Стальної І.Д. та Гаришвілі Т.Г. (1977). Визначення ДК ненасичених вищих масних кислот здійснювали за методом Стальної І.Д. (1977). Активність каталази вивчали за Королюк М.А. і співавт. (1988). Активність СОД визначали спектрофотометричним методом. Всі показники ПОЛ та системи АОЗ вивчали в супернатантах епітеліоцитів, отриманих після центрифугування (в здорових жінок) та в лаважній рідині (в пацієнток з БВ). Визначення вмісту циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ) проводили радіоімунним методом. Експресію молекул CD38 і СD95 на поверхні епітеліоцитів піхви вивчали методом непрямої імунної флуоресценції. Отримані цифрові результати опрацьовували статистично.
Секреція медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок. Базальний рівень секреції ІЛ-1 інтактними епітеліоцитами піхви до 24-ї години інкубації перевищив показник секреції ІЛ-2 в 1,83 рази, ІЛ-6 – в 2,53 рази, ІЛ-8 – в 1,69 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12 – в 3,07 та 2,15 рази відповідно (р<0,05 у всіх випадках порівняння). Порівняною з секрецією ІЛ-1 виявилась секреція ФНП-a. Вміст ТФР в середовищі культивування епітеліоцитів піхви виявився в 3,0 рази нижчим, ніж вміст ФНП-a, а концентрація гамма-ІФН – в 3,58 рази (р<0,05 в обох випадках). Базальний рівень секреції гамма-ІФН епітеліоцитами піхви склав 2,6±0,15 пг/мл. Найменш активно епітеліоцити піхви in vitro секретували ПГЕ2, концентрація якого склала 0,83±0,04 пг/мл, що було в 10,36 рази нижче порівняно з секрецією ІЛ-1, та в 11,2 рази – порівняно з продукцією ФНП-a.
Для дослідження секреторної активності епітеліоцитів піхви здорових жінок in vivo проводили визначення концентрацій медіаторів у лаважній рідині піхви. Встановлено, що in vivo продукція епітеліоцитами піхви ІЛ-1 була в 1,39 рази нижчою, ніж in vitro (p<0,05), продукція ІЛ-2 – в 1,205 рази нижчою (р<0,05), ІЛ-6 – в 1,26 рази (р<0,05), ІЛ-8 – в 1,19 рази (р<0,05), ІЛ-10 – в 1,27 рази (р<0,05), ІЛ-12 – в 1,11 рази (р>0,05), ФНП-a - в 1,24 рази (р<0,05), ТФР – в 1,29 рази (р<0,05), гамма-ІФН – в 1,44 рази (р<0,05), ПГЕ2 – в 1,46 рази (р<0,05).
Стан ПОЛ та системи АОЗ епітеліоцитів піхви здорових жінок. Базальна активність процесів ПОЛ в інтактних епітеліоцитах піхви здорових жінок характеризувалась значенням внутрішньоклітинного вмісту ДК, яке дорівнювало 0,26±0,01 мкмоль/л, та значенням МДА, яке дорівнювало 0,43±0,02 мкмоль/л. Для базального рівня системи АОЗ була характерна активність каталази, яка дорівнювала2,47±0,12 мкмоль/год* л, та активність СОД, рівна 0,75±0,04 МО/мг Hb.
Система циклічних нуклеотидів та експресія маркерів апоптозу епітеліоцитами піхви здорових жінок. Вміст цАМФ в епітеліоцитах піхви здорових жінок складав, в середньому, 2,37±0,12 пкмоль/6 lg клітин, що було в 2,08 рази більше, ніж внутрішньоклітинний вміст цГМФ (1,14±0,06 пкмоль/6 lg клітин).
Відносний показник епітеліоцитів піхви, які експонували на цитоплазматичних мембранах рецептор до моноклонального антитіла CD38 (неспецифічного маркеру апоптозу), склав 4,16±0,21 %, тоді як кількість епітеліоцитів піхви, які мали рецептор до специфічного маркеру апоптозу CD95, склала в загальній популяції клітин 2,05±0,10 % (кратність переважання CD38+-клітин над CD95+-клітинами – 2,03 рази, р<0,05).
Секреція медіаторів епітеліоцитами піхви жінок, хворих на БВ. Вміст ІЛ-1 в лаважній рідині, отриманій від пацієнток з БВ, був в 2,58 рази вищим порівняно з аналогічним показником в групі здорових жінок; вміст ІЛ-2 – в 2,09 рази, ІЛ-8 – в 2,1 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12 – в 2,09 та в 1,78 рази відповідно (р<0,05 у всіх випадках). З усіх досліджених інтерлейкінів найбільша продукція була зареєстрована для ІЛ-1, абсолютний рівень якого перевищував концентрацію ІЛ-2 в 1,97 рази, ІЛ-6 – в 2,76 рази, ІЛ-8 – в 1,77 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12, відповідно, в 3,48 та в 2,5 рази. Загальний вміст ІЛ-6 та ІЛ-8 склав 14,82 пг/мл.
Було відзначене значне збільшення вмісту ФНП-a, рівень якого в 2,18 рази перевищував аналогічний показник у групі здорових жінок. Збільшення концентрації ТФР в пацієнток з БВ склало 2,14 рази проти такої у здорових жінок, а кратність збільшення вмісту гамма-ІФН та ПГЕ2 – 2,78 та 2,0 рази відповідно.
Зі збільшенням ступеня тяжкості БВ секреторна активність епітеліоцитів піхви зростала, що мало прояв у збільшенні концентрацій досліджуваних медіаторів у лаважній рідині, отриманій з піхви пацієнток. Найбільша секреторна активність епітеліоцитів піхви була зареєстрована при IV ступені БВ, найменшу активність спостерігали у пацієнток з БВ I ступеня.
Стан процесів ПОЛ та системи АОЗ епітеліоцитів піхви жінок, хворих на БВ. В загальній групі хворих на БВ внутрішньоклітинний вміст ДК та МДА був суттєво вищим аналогічних показників у групі здорових жінок. Так, концентрація ДК в епітеліоцитах піхви, виділених від пацієнток з БВ, була вищою норми в 2,42 рази, а концентрація МДА – в 2,12 рази. Активність внутрішньоклітинних ферментів системи АОЗ в епітеліоцитах піхви пацієнток з БВ виявилась нижчою нормативних показників у 1,27 рази для каталази та СОД (р<0,05 в обох випадках). Внаслідок вказаних змін інтегральний показник ПОЛ/АОЗ збільшувався, перевищуючи показник в групі здорових жінок в 2,9 рази.
Підвищення активності процесів ПОЛ та зниження активності ферментів системи АОЗ мало місце у всіх групах жінок з БВ І-ІV ступенів. При цьому найменшу активність процесів ПОЛ та недостатність системи АОЗ спостерігали в жінок з БВ І ступеня, найбільшу – при ІV ступені захворювання.
Різноспрямовані зсуви в системах ПОЛ та АОЗ супроводжувались змінами коефіцієнту ПОЛ/АОЗ, абсолютні значення якого збільшувались. При БВ І ступеня коефіцієнт ПОЛ/АОЗ перевищував показник норми в 1,67 рази, при ІІ ступені – в 2,38 рази, при ІІІ та ІV ступенях – в 3,29 та в 4,67 рази відповідно.
Система циклічних нуклеотидів та експресія маркерів апоптозу епітеліоцитами піхви жінок, хворих на БВ. Внутрішньоклітинний вміст цАМФ в епітеліоцитах піхви пацієнток з БВ виявився в 1,13 рази вищим порівняно з аналогічним показником в групі здорових жінок. Внутрішньоклітинна концентрація цГМФ в епітеліоцитах піхви при БВ суттєво зменшувалась і була в 1,16 рази нижчою порівняно з такою в епітеліоцитах піхви здорових жінок. В зв’язку з вказаними змінами внутрішньоклітинного вмісту цАМФ та цГМФ інтегральний коефіцієнт цАМФ/цГМФ для епітеліоцитів піхви пацієнток з БВ був в 1,31 рази вищим, ніж в групі порівняння. У всіх випадках співставлення різниця між параметрами, які вивчали, була вірогідною.
В загальному пулі епітеліоцитів піхви, виділених від жінок, хворих на БВ, мало місце двократне збільшення кількості епітеліоцитів, які несли на цитоплазматичних мембранах рецептори до неспецифічних та специфічних маркерів готовності до реалізації апоптозної програми (СD38 та CD95). При цьому відносна кількість CD38+-епітеліоцитів піхви виявилась у 2,03 рази вищою, ніж CD95+-епітеліоцитів (р<0,05).
Виразність змін внутрішньоклітинного вмісту циклічних нуклеотидів в епітеліоцитах піхви, а також експресія маркерів апоптозу на даних клітинах збільшувались по мірі наростання ступеня дісбіотичних зсувів у жінок з БВ. Найбільш суттєві зміни досліджуваних показників були зареєстровані в групі пацієнток з БВ ІV ступеня.
Вплив ТК бактерій на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок in vitro. Стимулюючий вплив 10 мг/л ТК був неоднаковим в залежності від тривалості контакту з епітеліоцитами піхви здорових жінок. Найбільший стимулюючий ефект був зареєстрований на 96 годині культивування епітелоцитів з ТК. Найменша стимулююча дія мала місце на 24 годині досліду. Найбільш інтенсивно епітеліоцити піхви здорових жінок під впливом ТК в концентрації 10 мг/л продукували ТФР, гамма-ІФН, ФНП-a та ІЛ-1 (незалежно від тривалості контакту).
Інкубація епітеліоцитів піхви здорових жінок з 50 мг/л ТК викликала посилення секреції ІЛ-1 до 24 години в 2,17 рази порівняно з рівнем ІЛ-1 при дії 10 мг/л ТК, а також в 2,9 рази порівняно з нормою. Схожі зміни мали місце і відносно інших медіаторів. До 48 години рівень ІЛ-1 перевищив норму в 5,06 рази, а рівень ІЛ-1 на 24 годині – в 1,73 рази. Кратність переважання рівня ІЛ-1 над таким в дослідах з 10 мг/л ТК склала 2,25 рази (р<0,05). Рівень ІЛ-1 перевищував рівень ІЛ-2 в 2,25 рази, ІЛ-6 – в 3,15 рази, ІЛ-8 – в 1,88 рази, рівні ІЛ-10 та ІЛ-12 – в 4,73 та в 2,99 рази (р<0,05 в усіх випадках). На 72 годині культивування з 50 мг/л ТК секреція ІЛ-1 перевищила норму в 7,27 рази, а також була в 2,48 і 1,44 рази вищою рівнів на 24 та 48 годинах (р<0,05 в усіх випадках). Порівняно з рівнем ІЛ-1, зареєстрованим на 72 годині з використанням 10 мг/л ТК, ступінь збільшення секреції медіатора при використанні 50 мг/л ТК склав 2,23 рази (р<0,05). Схожу інтенсивність продукції відзначали і відносно ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-α, ТФР та гамма-ІФН. До 96 години дії 50 мг/л ТК рівень ІЛ-1 виявився в 10,62 рази вищим норми, а також був в 2,3 рази вищим порівняно з рівнем ІЛ-1 на 96 годині в досліді з 10 мг/л ТК. Для ІЛ-2 схожі зміни склали, відповідно, 10,1 та 1,93 рази, для ІЛ-6 – 10,6 та 2,32 рази, для ІЛ-8 – 8,94 та 1,94 рази, для ІЛ-10 – 6,1 та 2,34 рази, для ІЛ-12 – 8,7 та 1,83 рази. Рівень ФНП-a збільшився проти норми в 10,61 рази, рівень ТФР – в 13,87 рази, гамма-ІФН – в 15,85 рази.
На 24, 48, 72 та 96 годинах культивування з 100 мг/л ТК абсолютні величини вмісту ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ФНП-α, ТФР та гамма-ІФН вірогідно перевищували такі, зареєстровані на 24, 48, 72 та 96 годинах культивування епітеліоцитів з ТК в концентраціях 10 та 50 мг/л.
Вплив ПГН бактерій на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок in vitro. При контакті епітеліоцитів піхви з 10 мг/л ПГН протягом 24 годин мало місце збільшення рівня ІЛ-1 в 1,93 рази порівняно з нормою (р<0,05). Кратність збільшення секреції ІЛ-2 склала 1,55 рази, ІЛ-6 – 1,44 рази, ІЛ-8 – 1,51 рази, ІЛ-10 – 1,43 рази, ІЛ-12 – 1,38 рази, ФНП-a - 1,65 рази, ТФР та гамма-ІФН – 1,66 та 1,65 рази відповідно. Продукція ПГЕ2 при цьому збільшилась проти норми в 1,23 рази (р<0,05 в усіх випадках). Співставлення рівнів з аналогічними при досліді з 10 мг/л ТК дозволило відзначити, що під впливом 10 мг/л ПГН продукція медіаторів була вірогідно вищою (через 24, 48, 72 та 96 годин).