Реферат: Вплив кріодеструкції, екстрактів печінки і селезінки на відновні процеси в печінці при експериментальному цирозі
Інтегральним показником стану мікрогемоциркуляції органа може слугувати фрактальна розмірність D, за якою визначаються мікроархітектоніка судинного русла, діаметр судин, швидкість і характер кровотока, а також стан формених елементів крові в судинах. Значення D розраховували як кутовий коефіцієнт прямої, що апроксимує залежність кількості пікселів заданого забарвлення біооб'єкта від площі рамки, до якої вони потрапляють (Б. Мандельброт, 2002; Д.Г. Луценко, 2005).
Для гістологічних досліджень фрагменти печінки фіксували в 10%-му нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Одержані з парафінових блоків зрізи завтовшки 6-8 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином для отримання оглядових гістологічних препаратів. Стан сполучної тканини оцінювали в препаратах, забарвлених пікрофуксином по ван Гізон для виявлення колагенових волокон (О.В.Волкова и др., 1982).
Вміст ТБК-активних продуктів (ТБКАП)в сироватці крові визначали спектрофотометрично (В.В. Меньшикова, 1987).
Активності аланін- і аспартатамінотрансфераз (АлАТ і АсАТ) досліджували за методом Райтмана-Френкеля за допомогою стандартних наборів виробництва НПП "Фелісит діагноста" (Дніпропетровськ, Україна).
Статистичну обробку результатів проводили параметричним методом Фішера-Стьюдента з використанням t-критерію або непараметричним методом ANOVA. Кількісні дані в тексті дисертації представлені в середніх величинах і середніх квадратичних похибках. Для статистичної обробки результатів використовували пакет програм Statistica for Windows 5.1.
Результати власних досліджень та їх обговорення
Особливості мікроциркуляції крові в циротично зміненій печінці після кріогепатодеструкції, введення ксеноекстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки та їх поєднаної дії. Через 2 місяці з початку введення гепатотропної отрути щури були мляві, малорухомі, мали на череві пожовтілий смух. При макроскопічному дослідженні їхня печінка мала темно-бурий кольор, була щільна, пружна, горбиста, з нерівним краєм. У черевній порожнині визначалася асцитна рідина.У інтактних тварин печінка була бурого кольору, гладенька, еластична, з рівними краями.
Дослідження мікроциркуляції крові в печінці інтактних тварин показали, що кровоток в мікросудинах венулярного типу був швидкий, безперервний, гомогенний, із збереженням пристінного плазматичного шару. Функціонуючі синусоїди мали нормальне наповнення, їх діаметр складав 9,28±2,18 мкм. Термінальні печінкові венули мали середній діаметр 18,75±2,51 мкм. Відносна площа судинного русла у полі зору – 52,5±1,6 %.
Метод прижиттєвої мікроскопії в режимі люмінесценції дозволив досліджувати не тільки стан мікросудин печінки, але й жовчних канальців в поверхневих шарах паренхіми органа. Як люмінесцентну мітку застосовували внутрішньовенно введений 2% -й розчин ураніну. Його максимальне світіння в термінальних печінкових венулах спостерігалося в перші 5-10 хв після ін'єкції, потім уранін виходив за межі мікросудин, викликаючи однорідне світіння паренхіми. У наступні 10 хв флюоресціююча мітка проникала в жовчні канальці, внаслідок чого вони ставали видимими для спостереження. У нормальній печінці жовчні канальці утворювали рівномірну мережу з яскравим світінням.
Мікрогемоциркуляторне русло печінки щурів після двомісячного введення тетрахлорметану (1 група) відповідало картині цирозу печінки. При цьому спостерігалися різке зменшення кількості функціонуючих синусоїдів і присутність феномена звивистості. Діаметр термінальних портальних венул був зменшений, а діаметр печінкових венул – значно збільшений. Відносна площа судинного русла була вдвічі менша за норму і становила 27,35±2,92% у полі зору. Спостерігалася значна кількість шунтуючих судин. Порушення мікрогемоциркуляції виявлялося також у внутрішньосудинній агрегації еритроцитів, уповільненні кровотока, виключенні з кровотока частини синусоїдів. При введенні розчину ураніну виявлялись зміни в архітектоніці жовчних канальців. При цирозі спостерігалось різке зменшення жовчних канальців в полі зору, вони були потовщені, випрямлені, без сітчастої структури.
Біомікроскопічні дослідження печінки були проведені на 7, 14 та 30-ту добу з початку експерименту.
На 7-му добу печінка тварин усіх експериментальних груп була щільною, бурою, підтягнутою до діафрагми. Порушення архітектоніки мікроциркуляторного русла печінки, які були викликані експериментальним цирозом, зберігалися у всіх групах тварин. Статистично достовірних відмінностей в основних морфологічних показниках мікроциркуляторного русла не виявлено.
На 14-ту добу печінка дослідних тварин 2 та 3 груп була більш еластичною, ніж в контролі (1 група). В черевній порожнині спостерігалася невелика кількість асцитної рідини. У мікроциркуляторному руслі визначалося збільшення площі судин із швидким струменевим кровотоком, агрегація еритроцитів була відсутня. Статистично вірогідних відмінностей між досліджуваними показниками не виявлено (рис.1, табл. 1).
У тварин 4 групи, де кріодеструкція частини печінки була поєднана з введенням екстрактів, зникала звивистість синусоїдів, яка характерна для цирозу, збільшувалася кількість функціонуючих мікросудин.
Інтерпретацію даних щодо фрактальної розмірності проводили на основі положення теорії узагальненого броунівського руху. При цьому, якщо D ~ 1,0, то мікроциркуляція характеризується ламінарним рухом крові, а мікроангіоархітектоніка має чітко окреслену, згладжену топологію, евклідову геометрію судинного русла. Якщо D=1,5, то функціональна мікроангіоархітектоніка абсолютно стохастична, рух крові безладний, нерівномірний, а геометрія судин нагадує фіксовані траєкторії руху броунівських частинок, нетрадиційно хаотична.
Таблиця 1
Параметри мікроциркуляторного русла печінки щурів на 14-ту добу дослідження
| Параметри | Групи тварин | ||||
| Норма | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Середнє значення діаметра синусоїдів, мкм | 9,28±2,18 | 7,67±0,84 | 8,35±1,73 | 8,91±2,01 | 9,33±1,39 |
| Відносна площа мікросудин в полі зору | 0,53±0,02 | 0,27±0,03 | 0,45±0,03 | 0,52±0,02 | 0,54±0,06 |
| Фрактальна розмірність D | 1,29±0,04 | 1,21±0,02 | 1,34±0,05 | 1,34±0,05 | 1,32±0,05 |
Розраховане нами значення фрактальної розмірності D в нормі дорівнює 1,29, що відповідає складній фракталоподібній архітектурі мікросудин печінки, які повинні забезпечувати максимальний контакт з гепатоцитами (див. табл. 1).
Розвиток цирозу, поява безсудинних зон внаслідок некротизації ділянок печінки, різка зміна архітектоніки мікросудин (розширення портальних венул, стоншення синусоїдів і зменшення їх кількості і т.п.) відбилися у вірогідному зменшенні значення фрактальної розмірності D до 1,21. В той же час у всіх групах тварин, яким проводили стимуляцію регенераторних процесів, показано підвищення фрактальної розмірності D до 1,32-1,34, що навіть перевищує норму, хоча ці відмінності невірогідні. Можна припустити, що певне зростання хаотичності системи на даному етапі відбувається внаслідок запуску регенеративних процесів в печінці і відновлення її мікроангіоархітектоніки. Відмінності показників фрактальної розмірності D в печінці тварин після стимуляції регенераторних процесів і тварин контрольної групи (з експериментальним цирозом без лікування) також є вірогідними (див.табл.1).
На 30-ту добу експерименту видимі при біомікроскопічному дослідженні зміни стану печінки тварин різних груп нівелювалися.
У тварин 2 групи кількість функціонуючих мікросудин помітно збільшилась, ніж у тварин 1 групи, при цьому діаметр синусоїдів і кількість мікросудин менші, ніж у тварин 3 і 4 груп. Жовчні канальці починали формувати правильну мережу, хоча зустрічались ділянки з випрямленими жовчними канальцями. У тварин 3 і 4 груп ділянки без судин були практично відсутні, жовчні канальці формували мережу, близьку до нормальної.
Деструктивно-дистрофічні і репаративні процеси в циротично зміненій печінці при введенні ксеноекстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки після локальної кріогепатодеструкції. До початку експерименту у тварин спостерігалася картина вираженого цирозу печінки. Часточкова структура печінкової тканини була порушена, балочна будова нерегулярна. Паренхіма печінки фрагментована сполучнотканинними тяжами, в окремих ділянках з утворенням хибних часточок. Гепатоцити мали різний розмір і форму. Нерідко зустрічалися некротизовані клітини, переважно в центральних відділах печінкових часточок, а також осередки некрозу у середині хибних часточок. Відношення строми до паренхіми складало 7,41±1,15 (в нормі 0,98±0,09).
На 7-му добу експерименту значних відмінностей у гістологічній будові печінки тварин досліджуваних груп не спостерігалося.
На 14-ту добу експерименту в печінці тварин 1 групи (контроль) при мікроскопічному вивченні виявлялася жирова і балонна дистрофія. Балочна будова часточок не визначалася. Фіброзна тканина, що оточувала вузли-регенерати і створювала хибні часточки, була розвиненою, в ній спостерігалися фіброцити і фібробласти, що свідчило про подальше фіброзоутворення. Ознаки портальної гіпертензії відзначалися венозним застоєм, розширенням центральних вен, гемосидерозом, розширенням артерій портальних трактів.
У тварин 2 групи у цей же строк мікроскопічно визначалися вузли-регенерати, при цьому дистрофія гепатоцитів мала, в основному, гідропічний і балонний характер і лише подекуди виявлялася жирова дистрофія. Фіброзна тканина, яка оточувала хибні часточки, була розвинена, в ній поряд з одиничними фібробластами були наявні, в основному, фіброцити, що може свідчити про закінчення фіброзоутворення. Синусоїди були помірно розширені, ліпоцити (клітини Іто), які здатні синтезувати колаген, в перисинусоїдальному просторі не спостерігалися. Ознаки портальної гіпертензії виявлялися помірною дилатацією центральних вен і артерій портальних трактів. Трабекулярна будова в часточках печінки, що збереглися, починала відновлюватися.
Мікроскопічне дослідження гістологічних препаратів печінки тварин
3 групи на 14-ту добу показало, що в печінці формувався дрібновузловий цироз. Вузли-регенерати паренхіми не мали нормальної часточкової структури і були оточені фіброзною тканиною. Артерії в портальних трактах печінки були розширені, навколо центральних вен визначався застій крові з ознаками гемосидерозу. В окремих випадках виявлялося переповнення жовчних капілярів. У гепатоцитах спостерігалась переважно гідропічна та жирова дистрофія, трабекулярна будова паренхіми визначалася лише в 1/3 часточок.
При мікроскопічному дослідженні препаратів печінки тварин
4 експериментальної групи на 14-ту добу виявлено, що вузли-регенерати паренхіми печінки були майже одного розміру. При цьому дистрофія окремих гепатоцитів, в основному, визначалась як гідропічна. Паренхіма печінки нормалізувалася – навколо центральних вен формувались радіально розташовані печінкові балки (трабекули) і синусоїди. У синусоїдах реактивність печінкових макрофагів знижувалась. Виявлялася помірна дилатація вен. Сполучна тканина, яка оточувала тріади, була слабо інфільтрована, складалась переважно з фіброцитів – зрілих клітин сполучної тканини, що свідчило про закінчення фіброзоутворення. Сполучнотканинних тяжів, що йшли углиб паренхіми і створювали хибні часточки, виявлялось значно менше, ніж у контролі (рис. 2).
На 30 та 60-ту добу відбувалась подальша нормалізація будови печінки тварин, яка була найбільше виражена в 4 групі.
Для виявлення ступеня фіброзу в печінці тварин контрольної і 3-х експериментальних груп було проведено морфометричне дослідження показника співвідношення площі строми і паренхіми на гістологічних препаратах печінки в динаміці.
При морфометричному дослідженні препаратів, забарвлених по ван Гізон, було встановлено, що протягом 2-х місяців в циротично зміненій печінці показник співвідношення площі строми і паренхіми практично не змінювався. Це свідчить про необоротний характер фіброзу.