Статья: Биосинтез 2Н-меченого инозина высокого уровня дейтерированности

В работе использовали ² Н₂ О (99.9 ат.% ² Н), ² НСl (95.5 ат.% ² Н) и [U-² H]метанол (97.5 ат.% ² Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L - глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в ² Н₂ О, ² H₂ O дистиллировали над перманганатом калия с последующим контролем изотопной чистоты ¹ Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (Частота 70 МГц). Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-200⁰ С) после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот по разработанной раннее методике [7]. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs⁺ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 220-280 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (ФРГ) с охлаждением при -4⁰ С. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке Separon С18 (250 x10 мм), элюция смесью ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6 мл/мин. Ионообменную хроматографию осуществляли на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки) смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na⁺ -цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].

Биосинтетический ² Н-меченый инозин. Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной среде (89-90% ат. ² Н), используя в качестве источника ² Н-меченых ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. ² НСl30-40 мин при 08 ати), выделенный скринингом в условиях многостадийной адаптации на твердой среде М9 (2% агар) с 2% [U-² Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98% ² Н₂ О). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; ² Н-меченый гидролизат B. methylicum - 2; NH₄ NO₃ - 2; MgSO₄ ^. 7H₂ O - 1; Са₂ СО₃ - 2. Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-32⁰ С в условиях интенсивной аэрации реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).

Очистка ² Н-меченого инозина. Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g , 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст., добавляли ацетон при 0⁰ С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при -4⁰ С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g , 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 4⁰ С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50% этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 60⁰ С с обратным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH₄ -формиатным буфером (рН 8.9), промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl₂ . Инозин перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали методом ионообменной хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX 4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH₄ -формиатным буфером (рН 8.9) c 0.045 М NH₄ Cl в условиях изократической элюции (хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили методом ТСХ с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H -бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-70⁰ С. [a]_D ²⁰ 1.61⁰ (с 1.5 этанол). R_f 0.5. рК_a 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр(0.1 н. НСl) (l_max 249 нм, e₂₄₉ 7100 М^-1 см^-1 ); FAB-спектр (глицериновая матрица Cs⁺ , ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)⁺ m/z (I ,%): 273, 20% (4 ат. ² Н); 274, 38% (5 ат. ² Н); 275, 28% (6 ат. ² Н); 276, 14% (7 ат. ² Н), (А + H)⁺ 136, 46%; (Б + Н)⁺ 138, 55%; (Б - НCN)⁺ 111, 49%; (В - HCN)⁺ 84, 43%.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Young V.R., Yu Y.M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes ¹⁵ N, ¹³ C, and ² H as probes. in: New techniques in nutritional research // Whitehead R. G. (ed). Acad. Press. N. Y. 1990. V. 9. Р. 17-72.

2. Hruby V.J. // Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. 1985. V. 4. ¹1. Р. 287-292.

3. Nelson J.E., Ruo T.I. // Clinica Chemica Acta. 1988. V. 175. ¹ 3. Р. 59-65.

4. Stockman B.J., Reily M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. // Biochemistry. 1989. V. 28. ¹ 7. Р. 230-236.

5. McIntosh L.P., Dahlquist F.W. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ¹ 1. Р. 1-38.

6. Argade P.V., Rothschild K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. №3. P. 1643-1646.

7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. ¹ 10-11. С. 856-869.

8. Darmaun D., Robert J. J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. // Annales-d’ Endocrinologie. 1985. V. 46. ¹ 4. Р. 355-356.

9. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V. 8. ¹ 4. P. 231.

10. Fesik S.W., Zuderweg E.R.P. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. № 2. Р. 97-131.

11. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. //Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.

12. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. ¹ 3. С. 163-178.

13. Daub G. H . Syntheses with stable isotopes. in: Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference // Klein E. R. (ed). Academic Press. N. Y. 1979. Р. 3-10.

14. van der Berg E.M.M., van Liemt, Willem B.S // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ¹ 9. Р. 304-313.

15. Walker T. E., Matheny C. // J. Org. Chem. 1986. V. 51. Р. 1175-1179.

16. Фалеев Н.Г., Рувинов С. В., Сапоровская Н. В., Беликов В. М., Закомырдина Л.Н. // Изв. Ан. СССР. Сер. хим. 1989. Т. 10. Вып. 3. С. 2341-2343.

17. LeMaster D. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ¹ 2. Р. 133-174.

18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I . // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. ¹ 2. P. 225-229.

19. Crespi H.L., Marmur J., Katz J.J. // Nature. 1962. V. 84. ¹ 1. Р. 3489-3491.

20. Crespy H.L. Stable Isotopes in the Life Sciences. International atomic energy agency Press. Vienna. 1977. Р. 111-121.

21. Daboll H.F., Crespi H.L., Katz J.J. // Biotechnol. Bioengineer. 1962. V. 4. ¹ 5. Р. 281-297.

22. Cox J., Kyli D., Radmer R . // Trends Biotechnol. 1988. V. 6. № 12. Р. 279-282.

23. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. ¹ 3. С. 1-10.

24. Thomson J. F. Biological effects of deuterium. Pergamon Press. N. Y. 1963. P. 1-133.

25. Еремин В.А., Чекулаева Л.Н., Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. // Микробиология. 1978. Т. 32. Вып. 4. С. 629-636.

26. Busujima U.K., Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. ¹ 4. P. 1828-1832.