Статья: Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Вrevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтеро-метанол
Вследствие того, что большой интерес представляет использование данного штамма метилотрофных бактерий для наработки униформно меченного белка и аминокислот, было необходимо изучить уровни включения дейтерия в аминокислоты белковых гидролизатов B. methylicum, при росте бактерий на среде, содержащей максимальные концентрации тяжелой воды. Данные по степеням включения дейтерия в аминокислоты белка B. methylicum, полученного со среды, содержащей 98 об.% D2 O и 2 об.% СD3 ОD (табл.1, опыт (10)) представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, для таких аминокислот, как глицин и аланин дейтерирование в этих условиях близко к униформному, о чем свидетельствуют высокие степени включения дейтерия в эти аминокислоты, которые составляют 90 % и 97,5 % соответственно. Степень включения дейтерия в L-фенилаланин в составе гидролизатов белка биомассы в условиях максимально насыщенной дейтерием среды также высока, что составляет 95 % (примерно 8 атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий). Низкие степени включения дейтерия в другие аминокислоты белка, прежде всего в лейцин (изолейцин) (49 %) в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированном виде. По-видимому, в условиях ауксотрофности по лейцину вклад атомов дейтерия, синтезируемых de novo в степень дейтерированности самого лейцина, а также метаболически близких с ним аминокислот незначителен.
ТАБЛИЦА 2.
Степени изотопного включения дейтерия в аминокислоты белка B. methylicum , полученного на среде, содержащей 98 об.% D2 O и 2 об.% СD3 OD.
| Метиловые эфиры дансилпроизводных аминокислот | Молекулярные массы немеченных производных аминокислот, (М+.) | Молекулярные массы дейтерированных производных аминокислот (М+.), полученных на среде с 98 об% D2 O и 2 об% CD3 OD. | Степени изотопного включения дейтерия в аминокислоты, % |
| Dns-Gly-OMe | 322,2 | 324,0 | 90,0 |
| Dns-Ala-OMe | 336,4 | 340,3 | 97,5 |
| Dns-Val-OMe | 364,5 | 368,5 | 50,0 |
| Dns-Leu(Ile)-OMe | 378,5 | 383,4 | 49,0 |
| Dns-Phe-OMe | 412,0 | 419,6 | 95,0 |
| Dns-Asp-OMe | 394,5 | 396,5 | 66,6 |
| Dns-Tyr-(Dns)-OMe | 662,0 | 668,5 | 92,8 |
| Dns-Lys-(Dns)-OMe | 627,1 | 632,4 | 58,9 |
Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность использования штамма факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum для получения дейтерий-меченных аминокислот разной степени изотопной замещенности на дейтерий, в том числе и униформно меченных. Эти аминокислоты можно выделять как из культуральной жидкости, так и из гидролизатов биомассы. Выбор штамма для этих исследований представляется авторам оправданным, так как B. methylicum характеризуется устойчивостью к максимальным концентрациям тяжёлой воды в среде.
ЛИТЕРАТУРА .
1. Beaufrere B, Fournier V, Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology.- 1992 .- V.263. - N.1.- P.214-220.
2. Michalczuk L., Ribnicky D. M., Cooke T. J., Cohen J. D. // Plant Physiology. - 1992. - V.100. - N.3. - P.1346-1353.
3. Fesic S. W. and Zuiderweg E. R. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V.23. - N.2. - P. 97-131.
4. McIntosh L. P. and Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. N.1. P. 1-38.
5. Katz J., and Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.
6. Shimamura M., Kamada S., Hayashi T., Naruse H., Iida Y. // Journal of Chromatography. - 1986. - V.374. - N.1. - P. 17-26.
7. Hruby V. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. - 1985. - V.4. - P. 287-292.
8. LeMaster D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V.23. - P.133-174.
9. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. - 1994. - V.6. - P.165-176.
10. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. - 1993. - Т.9. - С.16-20.
11. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, - 1976. - С. 393.
12. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - V.37. - N.8. - P.911-918.
13. Vetter W , in: Biochemical Applications of mass-spectrometry (Walles G.R., and Dormor O.C.). - 1980. - First supplementary volume. - Wiley - Interscience. - N.Y. - USA. - P.439.
14. Campbell J., Weiner W.C., Chess E.K. et al. // Biomedical inveron. mass spectrom. - 1990. - V.19. - P.520-522.
15. Nesvera J., Patek M., Hochmannova J. et al., Appl. Microbiol. 35, 777-780, (1991).
О.V. МОSIN
Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after М.V. Lomonosov, 117571.
STUDYING OF BIOSYNTHESIS OF AMINO ACIDS BY BACTERIAL STRAIN В revibacterium methylicum ON MEDIA, CONTAINING HEAVY WATER AND DEUTERO-METHANOL.
The data on biosynthesis of deuterated amino asids using the L-phenylalanine producing strain of facultative methylotrophic bacterium B. methylicum are presented. Amino acids with varying levels of isotope enrichment as secreted into culture medium during fermentation and amino acids derived from protein hydrolyzates of B. methylicum were obtained via bioconvertion of СН3 ОН/CD3 OD on media containing various concentrations of heavy water (including 24,5 v/v. D2 O % up to 98 v/v. % D2 O). For studying of levels of isotope enrichment the method of electrom impact mass-spectrometry of methyl esters of dansylamino acids was employd. The level of isotope enrichment of phenylalanine secreted into cultural medium as well as phenylalanine derived from protein hydrolizates was varried from 27,5% to 97,5 % (in dependence on biosynthesis conditions). It was shown, that during fermentation the amount of other amino acids such as alanine, valine, and leucine(isoleucine) can be produced and accumulated in culture medium in addition to the main product of biosynthesis (phenylalanine).