Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.

Изучена возможность биосинтетического получения дейтерий-меченного инозина путём выделения из культуральной жидкости штамма- продуцента Bacillus subtillis . Метод получения инозина основан на использовании в качестве источника ростовых факторов при культивировании штамма-продуцента гидролизатов дейтерированной биомассы факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных со среды, содержащей 98 об.% ² Н₂ O и 2 об.% С² Н₃ О² Н. Приведены экспериментальные данные по росту штамма B. subtilis и биосинтезу инозина на среде, приготовленной из 99,9 ат.% ² Н₂ О и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий. Анализ степени дейтерированности инозина был проведён с использованием масс-спектрометрии FAB. Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени включения дейтерия в инозин (62,5 % атомов водорода в углеродном скелете молекулы замещены на дейтерий).

Ключевые слова: Bacillus subtillis . - Тяжёлая вода. - Дейтерий-меченный инозин. - Масс-спектрометрия.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время культивирование штаммов-продуцентов на тяжелой воде, открывает все новые возможности для получения широкого круга биологически активных соединений (БАС), в т.ч. нуклеозидов, меченных дейтерием [1-3]. В связи с этим перспективны биотехнологические процессы, в которых для роста на тяжелой воде используют штаммы продуценты нужных БАС, устойчивые к присутствию максимальных концентраций ² Н₂ O.

Основной трудностью при биосинтезе изотопно-меченных нуклеозидов является недостаток соответствующих ростовых субстратов. Начиная с первых экспериментов Катца с соавт. по адаптации и выращиванию клеток Chlorella на тяжелой были разработаны среды на основе экстрактов дейтерий-меченной биомассы микроводорослей как источников ростовых субстратов для культивирования других штаммов-продуцентов БАС [4]. Однако метод получения высокодейтерированных субстратов, хорошо апробированный на микроводорослях в лабораторных условиях, все же не находит широкого практического применения вследствие ряда трудностей, связанных, в частности, с адаптацией и культивированием микроводорослей в тяжелой воде, аппаратурной громозкостью технологической схемы, использованием фотореакторов и т.п.

Другими альтернативными источниками дейтерий-меченных соединений могут служить метилотрофные бактерии, интерес к которым все возрастает благодаря успешному развитию технологии химического синтеза метанола [5]. Усваиваемость биомассы метилотрофов клетками эукариот составляет 85-99 % [6], а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта достигает 50% [7]. Как было показано нами раннее, метилотрофные бактерии могут быть достаточно быстро и легко адаптированны к тяжелой воде [8-10]. В связи с этим, практический интерес представляет разработка на основе гидролизатов биомассы метилотрофов меченных сред для культивирования различных штаммов-продуцентов БАС, в частности нуклеозидов.

Целью данной работы было исследование принципиальной возможности использования гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий для получения инозина, высокомеченного дейтерием.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА.

В работе использовали безводные соли марки “х.ч.”(РФ), белково- витаминный концентрат дрожжей (Пензенский завод, РФ), ² Н₂ О (99,9% ² Н) и С² Н₃ О² Н (97,5 % ² Н), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ).

Бактериальные штаммы . Объектом исследования служил мутантный штамм B. subtilis , способный продуцировать и выделять инозин в культуральную жидкость при росте на среде, содержащей в качестве ростовых факторов сухую дрожжевую биомассу, полученную на углеводородах. Штамм был получен из коллекции культур ГКПМ Российского научно-исследовательского центра генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

B. subtillis был предварительно адаптирован к росту на тяжёлой воде путём рассева на среде, приготовленной на основе 99,9 ат. % ² Н₂ О и использован в качестве продуцента инозина при ферментации. Отобранный штамм проявлял высокую жизнеспособность и стабильность по признаку инозинообразования при многократном пассивировании на агаризованных (2%-ный агар) средах. Штамм поддерживали на агаризованной среде, содержащей ² Н₂ O.

В качестве источника ростовых факторов при культивировании штамма-продуцента инозина использовали штамм факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum , полученный в работе [8].

Сырую биомассу B. methylicum, полученную в полностью дейтерированной среде dM9 [11] автоклавировали в 0,5 н. растворе ² HCl (в ² H₂ O) при 08 ати в течении 30 мин.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [12].

Гидролиз белка проводили в 6 н. ² HCl (в ² H₂ O) (24 ч, 110 ⁰ С) [13].

Культивирование B. subtilis. Для получения посевного материала использовали среду следующего состава (в % по весу): глюкоза 2; пептон 2; бакто-витаминный концентрат дрожжей 2; NaCl 0,25.

Культивирование B. subtilis проводили на среде, приготовленной на основе 99,9 ат.% ² Н₂ О (dFM-среда), содержащей (в % по весу): глюкоза 12; автоклавированная биомасса метилотрофных бактерий B. methylicum 2,5; NH₄ NO₃ 3; MgSO₄ 2; мел 2.

Среды стериллизовали при 0,8 ати. в течении 30-40 мин, рН доводили до 7,0-7,2 с помощью гидроокиси калия. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (с наполнением средой не более 20 мл) в условиях интенсивной аэрации при 30-32⁰ С. После суток посевной материал переносили в ферментационную среду в количестве 5-10 об.%. и культивировали в течении семи суток как при выращивании посевного материала.

Выделение инозина . Клетки отделяли от культуральной жидкости на центрифуге Т-24 (Германия) (10 000 об/мин., 10 мин.). Супернатант концентрировали при 10 мм рт ст до объёма, в два раза меньше исходного. Белки удаляли, осаждая их метанолом при -4⁰ С, осадок отделяли центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин). К супернатанту добавляли 1 г активированного угля и выдерживали реакционную смесь при -4 ⁰ С в течении суток. Десорбцию инозина проводили 50 %-ным раствором спирта в 25 %-ном растворе аммиака, десорбант лиофилизовали. Полученный продукт дважды промывали ацетоном, сушили при 50⁰ С. Инозин перекристаллизовывали из метанола.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) инозина осуществляли на пластинках “Silufol UV- 254”(Чехо-Словакия) в системе: н-бутанол-уксусная кислота-вода, 2:1:1. Инозин идентифицировали по поглощению в УФ свете.

Содержание инозина в культуральной жидкости определяли на приборе “Beckman DU-6” (США) в пробах культуральной жидкости, объемом 10 мкл при помощи стандартной калибровочной кривой (249 нм). Элюцию пятен проводили дистиллированной водой.

Аминокислотный анализ белковых гидролизатов проводили на приборе “Biotronic LC 50001” (ФРГ), 230 x 3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч.

Уровни включения дейтерия в аминокислоты белка были исследованы методом масс-спектрометрии электронного удара на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япониня) после модификации аминокислот в метиловые эфиры дансиламинокислот по методике, указанной в работе [8].

Масс-спектры инозина получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) на глицериновой матрице, при потенциале 5 кВ и ионном токе 0,6-0,8 мА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение дейтерий-меченного инозина . Для получения дейтерий-меченного инозина использовали мутантный штамм B. subtillis (предварительно адаптированный к росту на среде, содержащей максимальные концентрации ² Н₂ O путём рассева), который вследствие нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов продуцирует и выделяет до 20 г инозина на 1 л культуральной жидкости. Иcследуемый штамм проявлял максимальную продуктивность по признаку инозинообразования на богатых ферментационных средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу (10-12 % от веса), а в качестве источника ростовых факторов и дополнительного источника азота белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей. Ввиду высокой стоимости дейтерий-меченных субстратов, и их малой доступности, было необходимо найти наиболее подходящий природный источник, из которого их можно легко выделять. В качестве такового использовали факультативные метилотрофные бактериии B. methylicum, которые весьма удобны для наработки высокодейтерированных БАС [см. например 8, 9]. Данный штамм метилотрофных бактерий, характеризовался устойчивым ростом и высокими выходами биомассы на среде, содержащей 98 об.% ² Н₂ О и 2 об.% С² Н₃ О² Н (см. диаграмму). Именно поэтому мы использовали гидролизаты его биомассы для культивирования штамма продуцента инозина.

При разработке рецептуры питательной среды учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 50% веса сухого вещества) [14], а также некоторое количество полисахаридов (до 10%) [15], причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтеро-метанол. Поскольку продуцент инозина является полиауксотрофным штаммом, нуждающимся для роста в тирозине, гистидине и аденине, было необходимо получать их из гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий. Для этого проводили два метода гидролиза биомассы: 1. автоклавирование биомассы метилотрофных бактерий в 0,5 н. растворе ² НCl (в ² Н₂ O) (30 мин, 08 ати). 2. гидролиз биомассы в 6 н. ² НCl (в ² Н₂ O) (24 часа, 110 ⁰ С). В предварительных экспериментах было показано, что по-первому варианту гидролиза биомассы реализуется гораздо большая питательность суспензии метилотрофных бактерий по-сравнению с гидролизом в 6 н. ² Н₂ Сl. Поэтому мы отдали предпочтение этому методу проведения гидролиза биомассы.

Количественный и качественный состав аминокислот биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum , а также степени дейтерированности аминокислот показаны в таблице. Как видно из данных таблицы, показателем, позволяющим надеяться на высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит максимальный уровень дейтерированности аминокислот суммарного белка этих бактерий.

ТАБЛИЦА.

Аминокислотный состав метилотрофных бактерий B. methylicum, полученных в полностью дейтерированной среде dM9 и их уровни дейтерированности.

Аминокислота	Содержание в белке, %	Уровни дейтерированости, %
Глицин	9,69	90,0
Аланин	13,98	97,5
Валин	3,74	50,0
Лейцин	7,33	49,0
изолейцин	3,64	49,0
фенилаланин	3,94	95,0
Тирозин	1,82	92,8
Серин	4,90	86,6
треонин	5,51	не определяли
метионин	2,25	не определяли
аспарагиновая кислота	9,59	66,6
глутаминовая кислота	10,38	70,0
Лизин	3,98	58,9
Аргигин	5,27	не определяли
гистидин	3,72	не определяли

Экспериментально разработанный способ получения дейтерий-меченного инозина представлен на схеме. Его основные этапы: наработка дейтерированной биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum путем культивирования бактерий в полностью дейтерированной среде dM9; выделение фракции общих белков биомассы и их гидролиз; ферментация базового штамма B. subtilis на среде, приготовленной на основе 99,9 ат% ² Н₂ О и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий; выделение инозина, включая его адсорбцию активированным углем, десорбцию спиртово-аммиачным (1:1) раствором и последующую кристаллизацию инозина из метанола. Чистоту полученного инозина контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя в качестве сравнения хроматографически чистые стандарты нуклеозидов. ТСХ инозина, выделенного из культуральной жидкости, показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с R_f = 0,51, соответствующего по подвижности чистому инозину.

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик B. subtilis . При изучении роста штамма B. subtillis и уровня накопления инозина в КЖ использовали следующие среды:

1). Ферментационная среда (FM-среда), приготовленная стандартно на обычной воде.

2). Ферментационная среда, приготовленная из 99,9 ат.% ² Н₂ O (dFM-среда) и содержащяя дейтерий-меченную биомассу метилотрофных бактерий, выделенную, соответственно из среды dМ9.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--