Учебное пособие: Картирование сложно наследуемых признаков человека
1. Все без исключения семьи оказываются полностью информативными для анализа сцепления.Когда в анализе сцепления используются случайные и некартированные ПДРФ-маркеры, мейозы, происходящие у индивидов, гомозиготных по одному из них, не являются информативными для анализа сцепления ПДРФ-маркера с интересующим нас заболеванием. Наличие плотной карты позволяет, однако, выбирать в любом районе несколько близко расположенных ПДРФ таким образом, чтобы все индивиды были заведомо гетерозиготными хотя бы по одному из них. Получение такой информации позволяет осуществить анализ полилокусного сцепления с помощью компьютера.
2. Наследование локуса, ответственного за заболевание, можно проследить более строго, используя фланкирующие маркеры.Бели между маркерами, расположенными по обе стороны от предполагаемого локуса, ответственного за болезнь, рекомбинация не наблюдается, можно быть уверенным, что данный локус, расположенный между ними, наследовался совместно с этими маркерами. В действительности, в генетике давно уже считается, что анализ по таким тройным перекрестам много точнее, чем по двойным. Повышенная точность упрощает процедуру принятия или отклонения гипотезы, и таким образом, уменьшает необходимое для анализа количество семей.
3. Можно одновременно проследить наследование нескольких разных районов генома. Это позволяет установить сцепление в случае генетической гетерогенности заболевания.
Нам представляется, что в будущем анализ сцепления первоначально будет основан на использовании стандартного набора приблизительно 150–200 высокоинформативных ПДРФ-маркеров, распределенных по всему генному, с интервалом около 15–20 см. После того как все изучаемые родословные окажутся генотипировэнными по каждому маркерному локусу, будет проведен компьютерный анализ, тестирующий каждый такой участок на наличие шансов за сцепление. Любой фрагмент, предположительно сцепленный с изучаемым признаком, будет изучен затем более подробно с использованием плотной карты ПДРФ, например с плотностью один маркер на каждые 3 см. Это позволит извлечь всю информацию, заключенную в родословной, и увеличит величину лод-балла. Естественно, при планировании такого анализа вполне уместен вопрос: сколько семей необходимо, чтобы при наличии редкой карты ПДРФ уловить хотя бы намек на сцепление, а для плотной карты ПДРФ иметь возможность доказать с определенностью наличие сцепления?
3. Планирование анализа сцепления для болезней с простым типом наследования
Под простым типом наследования мы понимаем, что болезнь: 1) наследуется как классический менделеевский доминантный или рецессивный признак, проявляющий полную пенетрантность, и 2) вызвана мутациями в одном локусе. Данные точных эпидемиологических исследований заболевания обычно дают основания судить о том, справедливо первое условие или нет. В противоположность этому второе условие обычно следует принимать на веру: не существует такого мощного метода для доказательства того, что мутации по одному локусу являются причиной данного заболевания, и в то же время существует много поводов усомниться в этом. Но к данному вопросу мы вернемся позже, при обсуждении генетической гетерогенности.
Болезнь Гентингтона и муковисцидоз являются яркими примерами признаков с доминантным и рецессивным типом наследования, соответственно. Оказывается, что в обоих случаях болезнь – следствие мутаций единичного локуса.
Для заболевания с простым типом наследования относительно легко построить карту сцепления. Рассчитав сумму ELOD-баллов, можно прямо оценить требуемую величину выборки. На рис. А, Б показано число ядерных семей с двумя или тремя пораженными, которое требуется, чтобы гарантировать 50%-ную вероятность успеха при картировании доминантного или рецессивного признака. Это число является функцией плотности расположения используемых ПДРФ-маркеров. Рисунок демонстрирует количество семей, необходимое 1) в случае, когда несколько маркеров рестрикционного полиморфизма используются по отдельности, и 2) если задействован весь потенциал карты ПДРФ, т.е. используются фланкирующие маркеры. Как следует из рис. 1, необходимое количество семей вполне эффективно при наличии геномной карты ПДРФ, отстоящих друг от друга на расстоянии 20–30 см.
Далее мы рассмотрим признаки с более сложным типом наследования и обсудим проблемы, возникающие при их картировании с помощью анализа сцепления, и пути их преодоления.
4. Осложнения: неполная пенетрантность и ошибки клинической диагностики
Генетический признак, для проявления которого необходимы дополнительные факторы, проявляет неполную пенетрантность. Эти факторы могут включать в себя условия окружающей среды, генетическое предрасположение, а также случайность. Простой пример – ретинобластома, при которой у индивидов, наследующих одну дефектную копию рецессивного онкогена, развивается рак, если вторая копия инактивирована событиями в соматических клетках; это случайное событие встречается достаточно часто, поэтому пенетрантность высока. В семьях с наследственными формами болезни Альцгеймера заболевание может не проявить полную пенетрантность попросту из-за того, что некоторые пораженные погибнут по другим причинам, так и не проявив симптомов. Синдром Вернике – Корсакова вызван, по-видимому, мутацией, приводящей к более слабому по сравнению с нормой присоединению транскетолазой тиаминпирофосфата, однако клинический фенотип проявляется только у больных, предпочитающих диету, обедненную тиамином; таким образом, степень пенетрантности может широко варьировать в зависимости от условий окружающей среды и точности определения фенотипа. Многие заболевания, такие, как наследственные формы маниакально-депрессивного психоза, проявляют неполную пенетрантность по неизвестным причинам.
В случае болезни, наследуемой как доминантный признак с полной пенетрантностью, здоровые дети от брака с одним больным родителем так же информативны, как и больные дети: в обоих случаях мы точно знаем, какой аллель локуса, ответственного за заболевание, был унаследован каждым из них. Однако, когда пенетрантность неполная, генотип здорового потомка от больного родителя всегда неоднозначен. Неудивительно, что и анализ наследуемых ими маркеров мало что может дать в этом отношении, поскольку мы не знаем точно, унаследовали они мутантный аллель или нет. Рис. 2 показывает, как быстро уменьшается величина суммарного лод-балла с уменьшением степени пенетрантности.
Проблема неопределенности генотипа здорового индивида возникает и в случае рецессивного признака при полной пенетрантности: существуют три возможных генотипа для группы здоровых сибсов, но только один – для группы больных. Для тесно сцепленного маркера отношение шансов будет 1: в случае здоровых сибсов и 1: в случае больных, что делает вклад в суммарный лод-балл от больных членов в 5 раз меньшим, чем у здоровых. Неполная пенетрантность только усложняет ситуацию.
Оценивая информативность семьи для анализа сцепления, необходимо обратить внимание на количество мейозов, порождающих появление больных индивидов. Сбор данных по здоровым сибсам не приведет к ошибке, но необходимо ясно представлять, что польза от этих данных для идентификации локуса, ответственного за болезнь, относительно невелика, кроме случаев доминантности с полной пенетрантностью.
Следует учесть, что неполная пенетрантность ^заметно осложняет анализ сцепления. Если в проверяемую на сцепление модель не заложена соответствующая степень неполноты пенетрантности, тогда истинное сцепление может быть полностью просмотрено: здоровые индивиды окажутся рекомбинантами. Чтобы исключить сцепление данной болезни с каким-либо районом, необходимо провести специальный анализ, принимая степень пенетрантности очень низкой. Величина суммарного лод-балла при этом будет отражать информацию, полученную от больных индивидов.
Обратным по отношению к проблеме неполной пенетрантности является вопрос о возможности ошибочной диагностики болезни у здоровых индивидов. В то время как неполная пенетрантность определяет неоднозначность генотипа здорового индивида и тем самым снижает его ценность в анализе сцепления, возможность неправильного диагноза означает, что и генотипы больных индивидов также должны рассматриваться как неоднозначные. Ошибочный диагноз маловероятен для таких явных заболеваний, как муковисцидоз, но представляет серьезную проблему при анализе психических нарушений. В диагностические критерии для этих заболеваний включено огромное количество поведенческих реакций, а наличие других больных в этой семье зачастую рассматривается как подтверждение диагноза. Используя рис. 3, можно оценить влияние данного уровня ошибок диагностики на анализ сцепления. Так как неправильная диагностика может серьезно отразиться на анализе сцепления, лучший выход из положения – приписывать всякому индивиду, диагноз которого сомнителен, «неизвестный фенотип». Только после обнаружения сцепления можно вернуться к таким индивидам и выяснить, унаследовали ли они генотип больного. Только таким путем можно узнать, являются ли неоднозначные симптомы проявлением исследуемого заболевания.
5. Осложнения: генетическая гетерогенность и фенокопии
Самым серьезным препятствием при изучении сцепления является генетическая гетерогенность, связанная с тем фактом, что мутации в разных локусах приводят к одномуфенотипу. Классические примеры генетической гетерогенности для низших организмов – прерывание автономного биохимического пути на любой из его стадий и потеря или нарушение гетеромультимерного белкового комплекса вследствие мутаций в структурном гене любой из его субъединиц. Несложно представить и другие возможные причины гетерогенности. Ими могут быть мутации регуляторных генов или посттрансляционные модификации. Хотя у низших организмов генетическая гетерогенность фенотипов является правилом, это не приводит к серьезным осложнениям, поскольку генетик всегда может поставить комплементационное скрещивание для проверки аллельности мутаций.
Феномен генетической гетерогенности у человека изучен в меньшей степени, однако нет оснований полагать, что в данном случае он более редок. К примеру, выяснилось, что наследственная метгемоглобинемия, которая ранее рассматривалась в клиническом отношении как однородная, может быть вызвана мутациями как альфа-, так и бета-цепей гемоглобина или даже мутациями NADH-дегидрогеназы. Эллиптоцитоз и болезнь Шарко-Мари-Туса оказались гетерогенными, поскольку в обоих случаях тесное сцепление, наблюдаемое в одних больших родословных, полностью отсутствовало в других. Сходная картина обнаружена и при изучении наследования маниакально-депрессивного психоза в большой родословной религиозной общины амишей, в которой было выявлено сцепление этого заболевания с одним из сегментов хромосомы Пр. В других больших родословных подобное сцепление не было обнаружено. По-видимому, пигментная ксеродерма и синдром Луи-Бар генетически гетерогенны, поскольку опыты invitro на клеточных экстрактах выявили соответственно девять и пять групп комплементации. Некоторые браки дают возможность исследовать комплементацию и у человека. Так, семьи, в которых оба родителя страдают альбинизмом, а все их дети – здоровые, демонстрируют генетическую гетерогенность альбинизма, на что ранее указывали фенотипические различия и популяционная генетика. Сходные данные предполагают гетерогенную природу врожденной глухоты.
Гетерогенность – это настоящий кошмар для генетика, поскольку в разных семьях можно найти свидетельства как в пользу сцепления, так и против него. Даже небольшая степень гетерогенности может сказаться на стандартном лод-балле, приводя к отрицательным значениям, даже если маркер тесно сцеплен с одним из локусов, контролирующих признак.
Возможное разрешение затруднений, вызванных гетерогенностью, состоит в следующем.
1. Дифференциация клинических форм заболевания. Наилучший способ преодолеть генетическую гетерогенность – это выявить клинический признак, по которому различные генетические формы четко отличаются: исследование одного гетерогенного нарушения сводится тогда к изучению двух или более гомогенных нарушений. Так, к примеру, клинические фенотипы были использованы для выявления двух форм нейрофиброматоза, которые по данным недавних исследований картируются в различных локусах.
К сожалению, пока нет единого правила, позволяющего безошибочно дифференцировать различные формы генетического заболевания. Клиническая картина заболевания может значительно варьировать вследствие как минимум трех причин:
а) единичная мутация в единственном локусе может экспрессироваться различным образом под влиянием несцепленного генетического локуса, выполняющего роль модификатора окружающей среды или в силу простой случайности;
б) различные мутации в одном локусе могут нарушить одну и ту же биохимическую функцию, но по-разному или с разной степенью, как это имеет место в случае мышечной дистрофии Бекера, которая вызвана менее тяжелыми по своему проявлению аллелями гена мышечной дистрофии Дюшенна;
в) заболевание может быть вызвано мутациями в нескольких разных локусах.