Учебное пособие: Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез

10. ДНКаза I. Приобретите сверхчистую, свободную от РНКазы ДНКазу I и приготовьте водный раствор в концентрации 1 мг/мл. Храните в аликвотах при – 20°С или –70°С. В своей работе мы пользовались ДНКазой фирмы CooperBiochemical.

11. ДСН. Приготовьте 25%-ный исходный раствор ДСН в воде. Если есть возможность, используйте реактив «сверхчистой» квалификации. Не автоклавируйте. Храните при комнатной температуре.

12. тРНК-носитель. На некоторых этапах процесса требуется тРНК-носитель, свободный от примесей РНКазы и ДНКазы. Мы рекомендуем использовать дрожжевую тРНК, тщательно очищенную следующим образом:

а) суспендируйте тРНК в ТЕ из расчета 20 мг/мл, добавьте ДСН до 0,1% и протеиназу К до конечной концентрации 100 кмг/мл;

б) инкубируйте при 37°–50°С в течение ночи;

в) экстрагируйте 3–4 раза фенолом и диализуйте в течение ночи против нескольких литров ТЕ;

г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.

4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей

Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:

1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.

2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой DowexAG50Wили ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.

Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.

4.2 Методы

4.2.1 Синтез РНК-зондов

Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции invitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:

9 мкл воды,

1 мкл рестрицированной матричной ДНК,

1 мкл смеси 3-NTP,

1 мкл «холодного» GTP,

1 мкл GTP,

2 мкл DTT,

2 мкл БСА,

2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.

2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.

3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.

4. Добавьте 1 мкл ДНКазы Iдля разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.

5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.