Одним из важных защитных механизмов можно считать действие различных АО, которые являются ингибиторами образования мЛНП.

1.4. АНТИОКСИДАНТЫ В ЖИВОМ ОРГАНИЗМЕ

В живом организме функционирует внутренняя система антиоксидантной защиты, представленная ферментами (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионредуктаза) и низкомолекулярными соединениями (тиоловые соединения, мочевая кислота, некоторые пептиды). Помимо этого, многие низкомолекулярные соединения, образующиеся в организме или поступающие с пищей (водорастворимые или жирорастворимые), способны служить в качестве компонентов антиоксидантной защиты клеток, внутри- и межклеточной жидкости (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, токоферол, флавоноиды, каротиноиды, и др.). Неферментные АО- низкомолекулярные соединения, перехватчики радикалов и активных кислородных метаболитов. Общим признаком очень многих АО является их способность выступать в качестве донора протона функциональной группы. По строению функциональной группы важнейшие для человека и млекопитающих низкомолекулярные АО можно разделить на соединения, содержащие SH-группы (тиоловые АО) и ОН- группы (фенольные АО) [15].

Тиоловые соединения

В свете современных данных становится все более очевидной ведущая роль тиоловых соединений в механизме антиоксидантной защиты. К такому заключению приводят несколько обстоятельств [19]. К примеру, основная часть функциональных компонентов антиоксидантной системы представлена веществами тиоловой природы. Так, в состав неферментного звена входят низкомолекулярные тиолы (глутатион, тиоредоксин и др.) и тиол содержащие белки, которые по некоторым данным [32] даже более реактивны по отношению к АКМ, чем глутатион. К тиоловым компонентам сыворотки крови млекопитающих относятся альбумины, представляющие собой важные внеклеточные АО [28]. Ферменты, принимающие участие в противоокислительной защите, либо относятся к собственному числу тиоловых энзимов, либо нуждаются в присутствии тиолов для проявления каталитической активности. Во-вторых, уникальные химические свойства тиолов наделяют их высокой антиокислительной способностью [15].

Фенольные соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо с несколькими ОН-группами, также являются мощными перехватчиками радикалов, эффективность которых возрастает в зависимости от количества гидроксильных заместителей цикле [15].

Важную роль в защите клеток, и главным образом, их мембран от окислительных повреждений играют токоферолы (ТФ), антиокислительное действие которых реализуется двумя путями. Во-первых, ТФ способны стабилизировать мембраны за счет хорошей растворимости в фосфолипидах и взаимодействия их с жирнокислыми цепями, что увеличивает плотность упаковки фосфолипидов в мембране и снижает вероятность их окисления. Вторым проявлением антиоксидантных свойств токоферолов является их способность перехватывать АКМ и ингибировать ПОЛ, в результате чего образуются малоактивные токоферильные радикалы, которые легко восстанавливаются аскорбиновой кислотой, убихиноном или мочевой кислотой, что обеспечивает регенерацию витамина Е [11, 22].

Одним из наиболее важных водорастворимых низкомолекулярных АО считают аскорбиновую кислоту , действие которой распространяется на широкий спектр АКМ. Способность аскорбиновой кислоты восстанавливать токоферил-радикалы обеспечивает синергическое действие системы аскорбат-токоферол в гетерогенных средах, содержащих водную и липидную фазы [24].однако в присутствии ионов металлов переменой валентности аскорбиновая кислота способна восстанавливать их, и, таким образом проявлять прооксидантное действие [8].

Мочевая кислота , помимо способности хелатировать ионы железа и меди, обладает прямым антиоксидантным действием за счет способности ингибировать оксиды азота, супероксид-анион радикал, гидроксильный радикал и синглетный кислород, а также гемовые оксиданты. Реакция мочевой кислоты с гидроксильным радикалом при физиологических рН в большинстве случаев приводит к конформационной перестройке молекулы с образованием аллантоина, в свою очередь способного окисляться гидроксильным радикалом до парабановой кислоты [11]. Ввиду высокого содержания мочевой кислоты в плазме крови (0,12-0,48 мМ), некоторые исследователи считают, что на ее долю приходится 35-65% защиты ЛПот окисления, 10-15% ингибирования гидроксильного радикала и 12% ингибирования синглетного кислорода.

В плазме крови имеется большое количество других соединений, способных взаимодействовать с АКМ и тормозящих развитие свободнорадикальных реакций посредством хелатирования ионов переменой валентности. К ним относятся железосвязывающие белки: ферритин, гемосидерин и трансферрины; медьсвязывающий фермент церулоплазмин; молочная и мочевая кислот; некоторые пептиды, гормоны и гормоноподобные вещества [11].

Таким образом, учитывая ведущую роль в патогенезе атеросклеротических повреждений процессов окислительной модификации ЛП, весьма интересным представляется изучение влияния пищевых АО (особенно жирорастворимых) в условиях гиперхолестеринемии, сопровождающейся окислительным стрессом, на атерогенез. Не менее важным представляется проанализировать комплексное воздействие эссенциальных жирных кислот класса Омега-6, Омега-3 и АО, так как известно, что ПНЖК являются быстроокисляемым субстратом (т.е. могут провоцировать развитие антиоксидантной системы), с одной стороны, и незаменимыми регуляторами состояния эндотелия, тонуса сосудов и процессов свертывания крови (т.е. могут препятствовать развитию антиоксидантной системы), с другой стороны.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И УСЛОВИЯ ОПЫТОВ

Изучение антиатеросклеротического действия СМЛР выполнено в эксперименте на животных в общепринятой модели. Эксперимент проведен на 30 половозрелых белых крысах-самцах Вистар весом 270-410 г. В зависимости от условий эксперимента животные были разделены на 3 равные по численности группы: контрольную и две опытные.

Таблица 1

Состав экспериментальных рационов

Наименование	Рацион (количество в г.)
	1	2	3	4
Казеин	197	197	197	197
Метионин	3	3	3	3
Крахмал	445	445	280	280
Сахар	175	175	175	175
Отруби	50	50	50	50
Масло подс. контр.*	45	35	10	-
Холина хлорид	5	5	5	5
Солевая смесь**	70	70	70	70
Витаминная смесь***	10	10	10	10
Холестерин	-	-	10	10
СМЛР****	-	10	-	10
Масло окисленное*****	-	-	190	190

* масло в 45 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола – 500 МЕ

** состав солевой смеси представлен в таблице 2

*** в 1 г содержит: тиамина (В₁ ) – 0,6 мг, рибофлавина (В₂ ) – 0,6 мг, пиридоксина (В₆ ) – 1,5 мг, никотиновой кислоты – 3,0 мг, пантотената кальция – 1,6 мг, фолиевой кислоты – 1,0 мг, цианкобаламина (В₁₂ ) – 0,003 мг, викасола – 0,1 мг, Д-биотина – 0,02 мг, токоферола ацетата – 15 мг, глюкозы – до 1 г.

**** - СМЛР содержит (г/100 г): нерафинированное масло льна – 14,3 , нерафинированное масло расторопши – 85,7, селена - 0,001 в составе селенопирана, жирнокислотный состав см. в таблице 3

***** - масло окисленное в 200 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола – 1500 МЕ

Таблица 2

Состав солевой смеси

№	Название соли	Химическая формула	Количество, г
1	Хлористый натрий	NaCl	139,3
2	Калий фосфорнокислый, однозамещенный	KH2PO4	388,8
3	Магний сернокислый	MgSO4	57,4
4	Кальций углекислый	CaCO3	380,4
5	Железо сернокислое	FeSO4*7H2O	26,4
6	Калий йодистый	KI	0,77
7	Марганец сернокислый	MnSO4*7H20	4,55
8	Цинк сернокислый	ZnSO4*7H2O	0,53
9	Медь сернокислая	CuSO4*5H2O	0,48
10	Кобальт хлористый	CoCl2*6H2O	0,024
11	Натрий фтористый	NaF	0,50
12	Алюмокалиевые квасцы	K2 SO4Al2(SO4)3*24H2O	0,11
ИТОГО	1000

На первом этапе эксперимента (14 дней) животные контрольной группы и первой опытной группы получали рацион, содержащий (по калорийности) 20% белка (казеин), 70% углеводов, 10% жиров (подсолнечное масло) (таблица 1, рацион 1). Животные второй опытной группы получали рацион с замещением части жира СМЛР (таблица 1, рацион 2). Витамины и минеральные вещества добавляли в соответствии с физиологическими нормами (таблица 1 и таблица 2). Корм животным давали вволю, доступ к воде был свободным.

На втором этапе эксперимента (28 дней) животные контрольной группы получали рацион 1, животные опытных групп получали высокожировой рацион (ВЖР), содержащий 10 г/кг холестерина и 40% жиров по калорийности (подсолнечное масло, перекисное число которого составляло 38 ммоль активного кислорода на 1 кг продукта). В первой опытной группе 5% жира замещали обычным (неокисленным) подсолнечным маслом (таблица 1, рацион 3), во второй опытной группе – СМЛР (таблица 1, рацион 4).

Таблица 3

Жирнокислотный состав смеси масел льна и расторопши (СМЛР)

Наименование	Количество, %
Сумма насыщенных жирных кислот	13,71
Сумма мононенасыщенных жирных кислот	27,39
Сумма ПНЖК, из них:	58,99
Линолевая (w-6) С18:2	50,1
g-линоленовая (w-6) С18:3	0,03
a-линоленовая (w-3) С18:3	8,86
Соотношение w-6/w-3	5,66

2.2. ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

После окончания эксперимента животных выдерживали 12 часов без корма, затем наркотизировали тиопенталом натрия в дозе 6 мг на 100 г веса. После чего вскрывали брюшную полость, пунктировали брюшную аорту и собирали кровь в пробирки с гепарином, центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Готовые гемолизаты эритроцитов (разведение 1:1) и плазму затем замораживали и хранили при – 18°С- – 20°С до исследования. Затем перфузировали печень in situ черезсоустье полой вены охлажденным физиологическим раствором. Далее извлекали печень, промывали охлажденным физраствором, продавливали через металлический пресс с диаметром отверстий 0,2 мм и готовили гомогенаты. Печень гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,18-0,2 мм) в течение 90 с при 1200 об/мин. Гомогенат хранили при –18°С- – 20°С.

Для гистологического исследования брали грудной и брюшной отдел аорты. Аорту фиксировали 10% формалином, вскрывали по длине, проводили макроскопическое исследование, далее готовили срезы методом парафиновой проводки, окрашивали гематоксилином + эозином, проводили микроскопическое исследование

2.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.3.1. Изучение антиоксидантных свойств селенопирана invitro

Изучение антиоксидантных свойств СП invitro проводили в системе нерафинированных растительных масел: подсолнечного, смеси масел льна и расторопши пятнистой. В модельной системе с подсолнечным маслом для сравнения использовали бутилокситолуол (БОТ) и ТФ. При этом концентрация АО (в том числе и СП) составляла 0,01% от массы. Контролем служило чистое масло. Окисление проводили при температуре 80 С, пропуская через масло воздух со скоростью 5 л/ч. Автоокисление смеси масел льна и расторопши (1:6, v/v) проводили в мягких условиях – при комнатной температуре без принудительного пропускания воздуха. СП или ТФ добавляли в смесь масел в концентрации 0,005%. Контролем служила смесь масел без АО. Количество пероксидов определяли йодметрическим титрованием [ГОСТ 26593-85].

2.3.2. Определение перекисного числа йодометрическим титрованием по ГОСТ 26593-85

Метод основан на окислении йодистого калия перекисями и гидроперекисями, содержащимися в образце, в растворе уксусной кислоты и хлороформа и титровании выделившегося йода раствором тиосульфата натрия.

Пробу отвешивают в колбу или пробирку, помещают навеску в колбу. Добавляют 10 см³ хлороформа, растворяют навеску, приливают 15 см³ уксусной кислоты и 1 см³ раствора йодистого калия, колбу сразу же закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 5 мин в темном месте при температуре 15-25°С. Затем добавляют 75 см³ воды, тщательно перемешивают и добавляют пять капель раствора крахмала. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия, используя раствор следующей концентрации в зависимости от предполагаемого значения перекисного числа. С (½Na₂ S₂ O₃ ) = 0,002 моль\дм³ , если перекисное число не более 6,0 моль\кг или с (½Na₂ S₂ O₃ ) = 0,01 моль\дм³ , если перекисное число равно или более 6,0 моль\кг [Издательство стандартов, 1994]. Массу пробы, необходимой для измерений, в зависимости от предполагаемого перекисного числа определяют по таблице:

Предполагаемое значение перекисного числа, моль\кг	Масса испытуемой пробы, г
От 0 до 6,0	5,000-2,000
От 6,0 до 10	2,000-1,200
От 10,0 до 15,0	1,200-0,600
От 15,0 до 25,0	0,600-0,500
От 25,0 до 40,0	0,500-0,300

Для каждой испытуемой пробы выполняется два измерения. Контрольные измерения проводят параллельно с основными измерениями. Если на контрольное измерение пойдет более 0,1 см³ (0,01 моль\дм³ ) раствора тиосульфата натрия, то проверяют соответствие реактивов стандарту.

Вычисление результатов измерения: Перекисное число Х в миллимолях активного кислорода на килограмм пробы вычисляют по формуле

Х = ( V ₁ - V ₀ )* c *1000 \ m

V ₀ –объем раствора тиосульфата натрия, использованный при контрольном измерении, см³

V ₁ -объем раствора тиосульфата натрия, использованный при измерении, см³

C – концентрация использованного раствора тиосульфата натрия моль\дм³

1000 – коэффициент учитывающий пересчет результата измерения в ммоль\кг