Дипломная работа: Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс

При хроническом ингаляционном воздействии кадмий вызывает тяжелые поражения легких. Как показали проведенные Шоповой В. Л. с сотрудниками исследования /17/, процент альвеолярных макрофагов (АМ) при воздействии кадмия в первый день значительно понижался (до 11,5%). Этот эффект наблюдался и на пятнадцатый день – АМ составил 45,5% от исходных значений. Одновременно резко повышался процент полиморфонуклеарных лейкоцитов (ПНЛ), среди некоторых встречались и незрелые формы. Средняя площадь АМ после химического воздействия увеличивалась за счет повышения процента очень крупных клеток, а не за счет равномерного увеличения площади всех клеток. При этом крупные АМ имели вакуолизированную пенистую цитоплазму. Встречались и клетки с пикнотическими ядрами, кариолизисом и кариорексисом. Все это указывает на то, что соединения кадмия существенно понижают содержание внутриклеточного АТФ и ингибируют клеточное дыхание.

В основе механизма токсического действия ионов тяжелых металлов, в том числе кадмия, лежит их взаимодействие с компонентами клеток, молекулами клеточных органелл и мембран.

Ионы металлов могут влиять на процессы, протекающие в клетке, только проникая внутрь ее и фиксируясь в субклеточных мембранах. Кадмий проникает в клетку через потенциал зависимые кальциевые канальцы. Воздействие кадмия на внутриклеточные процессы весьма разнообразны. Так, металл оказывает заметное влияние на обмен нуклеиновых кислот и белка. Он ингибирует invivo включение тимидина в ДНК регенерирующей печени, угнетает синтез белка в печени крыс на стадии инициации трансляции, нарушая образования полирибосом, тогда как процесс элонгации, напротив, ускоряется в результате активирования факторов EF– 1 и EF – 2 /9/. Избыток ионов кадмия ингибирует синтез ДНК, белков и нуклеиновых кислот, влияет на активность ферментов, нарушает усвоение и обмен ряда микроэлементов (Zn, Cu, Se, Fe), что может вызывать их дефицит. Следует заметить, что при достаточном поступлении цинка в организм токсичность кадмия снижается/8/.

С помощью электронной микроскопии было установлено, что кадмий вызывает ультраструктурные изменения клеточных мембран, митохондрий, цистерн аппарата Гольджи, сети трубочек, хроматина, ядрышка, микрофиламентов и рибосом/18/.

Поражение клеточной оболочки является наиболее ранним признаком действия данного металла, особенно при длительном поступлении, хотя клетки могли переносить поражения клеточной оболочки, а также митохондрий и в некоторой степени – аппарата Гольджи/16/.

При исследовании воздействия кадмия invitro на митохондриальную мембрану выявили, что ионы кадмия повышают проницаемость мембраны к ионам H, K, Mg, а это приводит к активации дыхания энергизованных нефосфорилирующих митохондрий/15/.

Известно, что некоторые ферменты в своей структуре имеют ионы металлов. Существует группа ферментов, в состав простетической части которых входят ионы металлов IV периода таблицы химических элементов, которые способны замещаться на любой двухвалентный ион металла (близкий по положению в таблице Д. И. Менделеева) /12/, в частности, к таким ферментам относятся щелочная фосфатаза и ряд протеаз /19/. На основании проведенных экспериментов можно предположить, что в результате замещения ионов в простетической части фермента один на другой происходит изменение пространственной конфигурации активного центра фермента, что приводит к изменению уровня его активности.

Свое токсическое влияние кадмий оказывает и на репродуктивные функции организма /20/. Эффект зависит от дозы вещества и времени воздействия. Основываясь на экспериментальных данных, полагают, что тератогенное действие кадмийсодержащих веществ может быть связано с ингибированием активности карбоангидразы /16/. Так, воздействуя на ткани семенников, кадмий вызывает уменьшение синтеза тестостерона /20/. Данный металл может приводить к гормональным нарушениям у самок, предотвращает оплодотворение, может вызывать кровотечения и даже приводить к смерти эмбрионов/9,21/. Установлено также, что кадмий способен накапливаться в плаценте и вызывать ее повреждение /7/. В исследованиях /9,21/ было выяснено влияние различных доз кадмия на эмбриональную смертность. Так, при введении металла в дозе 5 мг/кг впервые обнаруживаются мертвые эмбрионы, при 10 мг/кг наблюдается снижение средней массы плода, увеличение эмбриональной смертности в 2,8 раза, а при дозе 20 мг/кг – максимальное число мертвых эмбрионов на одно животное/20,22/.

В литературе описано также отдаленное воздействие кадмия на развитие потомства. В частности, в результате введения самкам раствора кадмия во время беременности и в период лактации, у потомства, подвергавшегося действию металла в эмбриогенезе, наблюдались нейрохимические изменения в мозжечке и в полосатом теле, и изменения моторной активности во взрослом состоянии/23/.

Таким образом, основываясь на литературных данных, можно отметить, что токсичность соединений кадмия следует рассматривать двояко. С одной стороны – это непосредственное действие ионов на организм. С другой стороны – влияние на потомство особей, подвергшихся действию соединений этого тяжелого металла.

1.2 Роль и структура аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы

1.2.1 Краткая история открытия реакции переаминирования аминокислот

Реакция переаминирования аминокислот была открыта учёными А.Е.Браунштейном и М.Г. Крицман в 1937 году при изучении дезаминирования глутаминовой кислоты в мышечной ткани /24/. Было замечено, что при добавлении к гомогенату мышц глутаминовой и пировиноградной кислот образуется L-кетоглутаровая кислота и аланин без промежуточного образования аммиака; добавление аланина и - кетоглутаровой кислоты приводило к образованию пировиноградной и глутаминовой кислот. В последующих исследования было показано, что реакции переаминирования широко распространены в живой природе и играют важную роль в сопряжении азотистого и энергетического обмена /25/.

Реакции переаминирования протекают при участии специфических ферментов, названых А.Е. Браунштейном аминоферазами (или по современной классификации, трансаминазами). Теоретически эти реакции возможны между любой амино - и кетокислотой, но наиболее интенсивно они протекают в том случае, когда один из партнеров представлен дикарбоновой амино - или кетокислотой. В тканях животных и у микроорганизмов доказано существование реакции переаминирования также между монокарбоновыми амино - и кетокислотами/26/.

В первых же работах, посвященных к открытию ферментативного переаминирования, А.Е. Браунштейн и М.Г. Крицман высказали предложение об образовании в ходе этой реакции основания Шиффа, подвергающегося таутомерному превращению и гидролизу; при этом указывалось на возможность участия в реакции промежуточного акцептора аминогруппы. Это предположение получило повреждение после открытия в 1944 году американским биохимиком Э. Снеллом новых биологически активных форм витамина - пиридоксаля и пиридоксамина, которым была приписана роль переносчика аминогруппы. В 1945-47г.г. были получены доказательства того, что фосфорилированное производное пиридоксаля- пиродоксаль --фосфат является коферментом аспартат-трансаминаз бактериальной и животного происхождения/27/. В 1954 году А. Майстер и соавторы установили, что частично очищенная апотрансаминаза активируется при помощи пиродоксаль – – фосфата в равной мере. Эти данные согласовались с ранее высказанными предложениями, согласно которым пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат подвергаются взаимопревращению в ходе катализируемой ферментом реакции, которая может быть представлена в виде суммы двух полуреакций /28/:

L-аппарат + ПЛФ оксалацетат+ПМФ

ПМФ + 2 – оксоглутарат L – глутамат + ПЛФ

ПЛФ – пиридоксальфосфат, ПМФ- пиридоксаминфосфат.

Окончательные доказательства этого механизма были получены в конце 50-х годов получения высокоочищенных препаратов аспартат-трансаминазы из сердца свиньи. Исследуя эти препараты, удалось подтвердить наличие прочно связанного пиридоксальфосфата в трансаминазе и доказать при помощи химических и спектрофотометрических методов, что L- глутамат или L- аспартат вызывает превращение обращается при добавлении 2 – оксоглутарата или оксалацетата/25/. В реакции переаминирования участвует - аминокислота как донор аминогруппы и -кетокислота как акцептор аминогруппы. Донорами могут служить также -,-, - и - аминогруппы ряда аминокислот (например, у орнитина - группа находится в - положении, у -аланина - в -положении/13/.

1.2.2 Структура аспартат-трансаминазы

Трансаминазы имеются во всех животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. В настоящее время известно около 60 трансаминаз, различающихся по субстратной специфичности. Из них лучше всего исследована аспартат-трансаминаза, при изучении которой удалось наиболее близко подойти к раскрытию молекулярного механизма переаминирования. Важным этапом в изучении аспартат-трансаминазы явилось определение её пространственной структуры при помощи метода рентгеноструктурного анализа/29/.

В начале 60-х годов было обнаружено, что в тканях животных содержатся два изофермента аспартат-трансаминазы: цитозольный и митохондриальный; их изоэлектрические точки равны соответственно ~6 и 9/30/. Несмотря на идентичность основного каталитического механизма, цитозольный и митохондриальный изоферменты различаются по многим каталитическим параметрам: удельной активности и сродству к пиродоксальфосфату, сродству к субстратам и PH-оптимуму активности. Оба изофермента имеют большее сродство к субстратам с четырёхуглеродной цепочкой, чем к пятиуглеродным субстратам. Но митохондриальный изофермент связывает L-аспартат в несколько раз лучше, а 2-оксоглутарат существенно хуже по сравнению с цитозольным изоферментом. Изоферменты различаются по способности катализировать переаминирование ароматических аминокислот, сродству к анионам, доступности инактивации трипсином и некоторыми реагентами, термостабильности и ионизации фосфатной группы кофермента.

В 1972 году под руководством Ю.А. Овчинникова и А.Е. Брауцштейна была завершена работа по определению первичной структуры цитозольной аспартат-трансаминазы из сердца свиньи/31/. К настоящему времени определены полные аминокислотные последовательности двух цитозольных изоферментов (из сердца свиньи, курицы, из печени крысы и индюка). Молекулы обоих изоферментов построены из двух идентичных полипептидных цепей (субъединиц), каждая из которых содержит одну молекулу прочно связанного с белком пиридоксальфосфата. Полипептидная цепь цитозольных аспартат-трансаминаз свиньи и курицы состоит соответственно из 412 и 411 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу около 46,5 кДа. Полипептидная цепь митохондриальных изоферментов свиньи и курицы состоит из 401 аминокислотного остатка и имеет молекулярную массу около 45 кДа. Оба изофермента синтезируются на рибосомах в цитоплазме клетки, причём митохондриальный фермент-в виде профермента, который содержит на NH2 –конце дополнительный пептид (“сигнальный”), состоящий из 29 аминокислотных остатков. Образование активной формы фермента связано с отщеплением этого пептида/28/.

В 1977 году была определена трёхмерная структура трансаминазы. Позже за рубежом были начаты рентгеноструктурные исследования других изоферментных форм аспартат-трансаминазы/29/. Определение трёхмерной структуры позволяет выявить связи между особенностями структуры и функции изоферментов. Рассмотрим результаты изучения трёхмерной структуры цитозольной куриной аспартат-трансаминазы.

Молекула состоит из двух идентичных субъединиц. Максимальные размеры молекулы составляют 110×70×60А. Белок характеризуется высоким содержанием вторичной структуры; на долю α-спиралей, β-слоя и реверсивных поворотов приходится соответственно 47,13 и 9% аминокислотных остатков. Субъединицу аспартат-трансаминазы можно условно разделить на 3 части: большой домен, малый домен и переходные участки между ними. Большой домен образован остатками с 75 по 300; его основу составляет сильно изогнутый слой (β-слой), состоящий из 7 β-цепочек, окружённых α- спиралями. Большой домен является наиболее стабильной частью субъединицы, к нему присоединён пиридоксальфосфат. Малый домен состоит из тесно сближенных NH2 –и СООН – концевых участков полипептидной цепи, а именно из остатков с 15 по 50 и с 360 по 412. Из малого домена выходит NH2 – концевой фрагмент цепи, который пересекает вход в активный центр и затем вплотную прилегает к поверхности большого домена смежной субъединицы. Большой и малый домены связаны двумя переходными участками: с NH2 – конца – участком цепи, состоящим из остатков 300-360. Оба переходных участка образованы преимущественно - спиралями, лежащими на поверхности молекулы/29/.

Оба активных центра аспартат-трансаминазы расположены в глубоких впадинах на противоположных сторонах молекулы на границе между субъединицами. Стенки каждого из активных центров образованы большим и малым доменом одной субъединицы и краем большого домена другой смежной субъединицы. В состав активного центра входят аминокислотные остатки, принадлежащие обеим субъединицам; этим объясняется отсутствие каталитической активности у мономера, кофермент связан в глубине щели активного центра на расстоянии ~8-10 А° от поверхности молекулы. Сторона А пиридированого кольца обращена к β - слою и метильной группе остатка Тrp-140 (стороны пиридинового кольца обозначены в соответствии номенклатурой JUPAC). Угол между плоскостями пиридинового и индольного колец составляет ≈40-45°, между кольцами возможно стэкинг-взаимодействие. Остаток пиридоксальфосфата связан альдиминной связью с ε-NH2-группой лизина-258. Коферментами трансаминаз являются производные пиридоксина-пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат. Оба кофермента обратимо переходят друг в друга в ходе реакции переаминирования. Трансаминазы для катализа требуют оба кофермента, в отличие от других ферментов/13/.

1.2.3 Механизм реакции переаминирования

Общая теория пиридоксалевого капитализма была разработана в 1952 году А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным, а несколько позднее – Д.Е.Мецлером и Э.Снеллом. Согласно этой теории действие пиридоксалевых ферментов обусловлено способностью альдегидной группы пиридоксальфосфата образовывать с аминокислотами альдимины (основания Шиффа) (рисунок1)/27/. В образующемся альдимине имеется система сопряженных двойных связей, по которой происходит смещение электронов от α – углеродного атома аминокислоты к электрофильному атому азота пиридинового кольца кофермента. Понижение электронной плотности у α – углеродного атома приводит к поляризации и ослаблению связей у этого атома.