Рис. 6. Герметизированная ячейка для нанобиоэлектрохимических измерений: 1 – рабочий электрод; 2 – тефлоновая втулка; 3 – вспомогательный электрод; 4 – тефлоновый стакан; 5 – тефлоновая крышка; 6 – ввод для гелия; 7 – капилляр для отвода газов; 8 – стеклянный капилляр Лугина–Гебера; 9 – мешалка; 10 – электрод сравнения; 11 – компенсационный электрод.

Перед измерениями фторопластовую ячейку промывали раствором хромовой смеси, 1 М раствором Н₂ SO₄ , 24 ч. вымачивали в бидистиллированной воде, промывали раствором "пираньи" [16] для снятия всех органических загрязнений и потом трижды промывали дистиллированной водой.

Электрохимическая ячейка (рис. 6.) с четырьмя электродами: рабочим игольчатым Pt с поверхностью 0.53 см² ; основным вспомогательным Pt, расположенным в отдельном отсеке, с площадью поверхности 0.45 см² , диаметром 0.5 мм; вторым вспомогательным Pt – электродом, который использовался для увеличения быстродействия работы потенциостата. Электродом сравнения служил стандартный серебрянохлорный электрод сравнения (х.с. э.) с Е_ст = 0.226 В при 20 °С, находящийся в дополнительном отсеке и соединенный с отсеком рабочего электрода через тефлоновый шлиф, во избежание влияния Сl^– – ионов на электродный процесс. В качестве стандартного раствора для серебрянохлорного электрода использовали раствор насыщенного хлористого калия. Все потенциалы в данной работе приведены относительно х.с.э.

2.3 Электроды

Как материалы, используемые в подкладках сенсорных электрохимических устройств, используют чистые Pt, Au, SiО₂ и графитовые материалы квалификации о.с.ч. 00 или о.с.ч. 000. Биосенсоры для особых целей содержат подкладки из сверхчистых монокристаллов металлов или оксидов, которые содержат ориентированы индексные грани, например Pt (001), Pt (010) или Pt (111). Pt обладает рядом достоинств, таких как воспроизводимость электрохимических свойств поверхности электрода, возможность эффективного снятия с её поверхности адсорбированных примесей, широким электрохимическим окном – широкой двойнослойной областью потенциалов в растворах индифферентных электролитов (малые токи заряжания). Подготовка заключалась в выдержке Pt 00 в течении 20 мин. в концентрированной HNO₃ , в тщательном промывании в бидистилляте. После этого снятие органических примесей и физических загрязнений осуществляли в растворе пираньи 1:1 (H₂ SO₄ конц/Н₂ О₂ 35%) при времени выдержки 40 мин, Т=20⁰ С. Эта процедура приводила к повышению активности поверхности Pt–электрода. Такая обработка дала возможность снять адсорбированные вещества с поверхности электрода, растворить поверхностный оксид, стандартизировать подготовку электродов и добиться воспроизводимости измерений.

Для очистки Au и Pt электродов от загрязнений и органических примесей, антител и антигенов использовали раствор "пираньи", который включал серную концентрированную кислоту H₂ SO₄ и перекись водорода H₂ O₂ в соотношении 8:3. Электроды выдерживали в этом растворе в течение 30 минут при 40 ⁰ С.

Активацию Au и Pt электродов проводили в растворе концентрированной азотной кислоты.

2.4 Очистка и подготовка растворов

Все использованные в экспериментах реактивы Kсl, Nа₂ нро₄ , Нno₃ были марки х.ч. Растворы готовили на дистиллированной воде. Очистку растворов осуществляли наложением прямоугольных импульсов потенциала на рабочий электрод от потенциостата ПИ 50.1.1, на внешний вход которого от внешнего программатора ПР–8 подавались управляющие импульсы напряжения прямоугольной формы. С помощью дозатора UNI 2010 готовили растворы АСКМ (сыворотки крови мышей, вакцинированных белковым полисахаридом фракцией синегнийной палочки) в PBS. Объем фонового раствора электролита PBS в ячейке составлял 40 мл.

Все измерения проводились при 20 ⁰ с. В качестве фонового раствора электролита был выбран фосфатный буферный раствор (PBS) следующего состава: 8 г/л NaСl, 0,2 г/л KСl, 1,44 г/л Na₂ НРО₄ , 0,24 г/л KН₂ РО₄ , рН = 7,4, приготовленный на бидистиллированной воде. Все потенциалы в работе приведены относительно стандартного серебрянохлорного электрода сравнения.

2.5 Стратегия создания биосенсора для регистрации P.AERUGINOSA АТСС 27853

Основываясь на мировых фундаментальных исследованиях создания и конструирования биосенсорных систем для регистрации разных бактериальных штаммов и экспериментальных работах [17-26] для создания биосенсора на P. aeruginosa АТСС 27853 была предложена следующая структурная схема построения трандьюсера:

Рисунок 7. Структурная схема построения трандьюсера.

РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований

На рисунке 8 показана схема созданного нами биосенсора на P.aeruginosa АТСС 27853 с наноразмерной по координате электрохимической реакции биохимически активной мембраной.

Рисунок 8. Схема компановки биосенсора с нанопреходами по координате электрохимической реакции для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853.

Взаимодействие антиген-антитело приводит к изменению электростатических характеристик ДЭС, следствием чего является рост тока во внешней цепи электрохимической ячейки.

Поскольку большая доля биосенсоров, в состав которых входит трандьюсер, является электрохимическими устройствами, то их работоспособность и воспроизводимость измеряемых данных в значительной мере зависит от материала рабочего электрода, его чистоты. Для массового производства биосенсоров можно использовать Pt о.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00.

Нами проведено изучение электрохимического поведения Pt о.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00 в фосфатном буферном растворе (PBS),который использовался в качестве поддерживающего электролита. На рис. 9 показаны ВАХ (вольтамперные характеристики) от межфазной границы раздела Pt/ PBS в зависимости от скорости развертки (V/s) по потенциалу Е. При медленных развертках ЦВАЗ имеет один катодный максимум тока на катодной волне, а сами токи являются токами заряжения. С увеличением скорости развертки величина регистрируемых токов увеличивается, а токи определяются электрической емкостью ДЭС (двойного электрического слоя) межфазной границы. При больших скоростях развертки по потенциалу на ЦВАЗ не наблюдается токовых максимумов, а анодный и катодный ток плавно увеличивается или уменьшается в зависимости от потенциала. Анодная и катодная зависимости ВАХ обусловлены двумя процессами заряжения. Pt после подготовки активная, на что указывают большие анодные и катодные токи электродных процессов, которые реализовываются на ней. Однако форма и характер этих кривых указывает на то, что она находится в состоянии окисления. На рисунке 9 показаны ЦВАЗ при малых скоростях развертки по потенциалу в увеличенном масштабе по сравнению с рисунком 10. При самой медленной скорости развертки по потенциалу в диапазоне от 0.000 до 0.800 В через межфазную границу текут наноамперные токи, указывая на хорошую поляризуемость Pt электрода и на то, что для анодной волны протекают лишь токи заряжения.

Рисунок 9.ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод Pt 00. S = 0.53 см² . Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщен. KСl. Крутизна 1 мА/V. 1 – V/s = 5•10⁰ ; 2 – V/s = 5•10^-1 ; 3 – V/s = 5•10^-2 ; 4 – V/s = 5•10^-3 .

Параметры потенциостата:

mV	T	mV	S (V/s)
шаг 1	0	10 с	шаг 5	1100	5·10(0)
шаг 2	0	1 с	шаг 6	0	5·10(0)
шаг 3	0	1 с	шаг 7	1100	5·10(0)
шаг 4	0	1 с	шаг 8	-300	5·10(0)

Рисунок 10. ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод – Pt 00. S = 0.53 см² . Крутизна 1 мА/V. 3 – V/s = 5·10^-2 ; 4 – V/s = 5·10^-3 .

Параметры потенциостата:

mV	t	mV	S (V/s)
шаг 1	0	10 с	шаг 5	1100	5·10(-2)
шаг 2	0	1 с	шаг 6	0	5·10(-2)
шаг 3	0	1 с	шаг 7	1100	5·10(-2)
шаг 4	0	1 с	шаг 8	-300	5·10(-2)

ЦВАЗ, полученную на Pt 00 после обработки в растворе концентрированной HNO₃ и обработанную дополнительно в растворе пираньи, мы сравнили с ЦВАЗ, полученной на Pt 00 после обработки в растворе царской водки и обработанной в растворе пираньи (рис. 10). Сравнение кривых "1", "2" и "3" показывает, что в последнем случае поверхностный оксид снят с поверхности Pt 00, а ЦВАЗ, полученная в последнем случае, имеет два максимума тока. Первый, при потенциале 0,03 В, второй при потенциале 0,10 В характерных для адсорбции разных форм водорода в растворах кислот как на чистой платине, так и на разных индексных гранях в соответствии с работами Делахея. После нанесения на поверхность Pt 00 наномолекулярного слоя антитела к P. aeruginosa АТСС 27853 активность Pt 00 электрода подавляется рис.11, кривая "3". При катодных потенциалах восходящая ветвь ЦВАЗ на Pt электроде, который содержит 2 наноразмерных слоя антител совпадает с восходящими кривыми "1", "2". При анодных потенциалах эта же кривая 3 совпадает с кривой 4 как на восходящем, так и на нисходящем, участках ЦВАЗ. Таким образом, наноразмерный 2-молекулярный слой антител модифицирует поверхность Pt электрода и ограничивает минимальные токи, которые проходят через эту границу как в анодной области, так и в катодной. К этому факту мы вернемся позже, при обсуждении взаимодействия этой модифицированной межфазной границы с антигенами P. aeruginosa АТСС 27853. Важным является также тот факт, что на катодной волне пиков тока восстановления оксида Pt ни в одном из данных случаев не наблюдается. Это указывает на то, что поверхность Pt электрода ни в одном из них не окисляется. Форма и ход ЦВАЗ в фосфатном буфере зависит лишь от токов заряжения межфазной границы и обусловлена ориентацией молекул воды, ионов гидроксония и ОН – групп на поверхности электрода и количеством этих частей, которые вошли в ДЭС.

Рисунок 11. ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод Pt 00. S = 0.53 см² . Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·10⁰ . 1 – чистая Pt обработанная в растворе конц. HNO₃ 40 мин. и потом в растворе пираньи; 4 – чистая Pt обработанная в царской водке 10 мин., затем в растворе пираньи; 3 – Pt/ 2 наномолекулярных слоев ІМ АСКМ/ PBS; 2 – чистая Pt обработанная в царской водке, в растворе конц. HNO₃ 40 мин., затем в растворе пираньи.

Параметры потенциостата:

mV	t	mV	S (V/s)
шаг 1	0	10 с	шаг 5	1100	5·10(0)
шаг 2	0	1 с	шаг 6	0	5·10(0)
шаг 3	0	1 с	шаг 7	1100	5·10(0)
шаг 4	0	1 с	шаг 8	-300	5·10(0)