Дипломная работа: Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе
Предложены различные методы определения активности КПН. Наиболее широко применяется метод Fricker и Snyder [194], с использованием дансилированных трипептидов – дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг – в качестве субстратов. Для определения активности КПН предложены также даларгин [127], лей5 -энкефалин-арг6 [127], [3 Н]-бензоил-фен-лей-арг [247], [3 Н]-бензоил-фен-ала-арг [247]. Количественное определение КПН в тканях производится методом связывания [3 Н]ГЭМЯК [263].
Согласно первоначальным исследованиям фермент представлен в организме двумя формами - растворимой и мембраносвязанной, которые отличаются по величине Мr [187, 193, 205, 264], значение которой для мембраносвязанной формы выше. Такое отличие связывали с наличием у мембраносвязанной формы С-концевой “якорной” последовательности, состоящей из 15-20 гидрофобных аминокислотных остатков, основное назначение которой состоит в обеспечении рН - зависимой ассоциации КПН с мембранами. Показано также, что активность мембраносвязанной КПН намного меньше активности растворимой формы данного фермента [189, 264]. Было выдвинуто предположение, что фермент, связанный с мембранами секреторных гранул, является предшественником растворимой формы КПН и превращается в нее в результате протеолитического расщепления связи c C-конца у основания “якорной” последовательности. Показано, что при этом активность фермента возрастает в 2-3 раза [186]. По мнению ряда авторов, такое различие в активностях мембраносвязанной и растворимой форм КПН может быть связано ассоциацией менее активной формы с компонентами мембран [71], что ставит под сомнение гипотезу о зависимости активности мембраносвязанной формы от наличия гидрофобной “якорной” последовательности.
В дальнейшем было обнаружено, что фермент, связанный с мембраной секреторных гранул отличается от растворимой формы не только по величине Мr, но и по локализации. Так в хромаффинных гранулах надпочечников, в мозге, передней и промежуточной доле гипофиза преобладает растворимая форма КПН, а мембраносвязанная форма локализована преимущественно в задней доле гипофиза [37, 40, 186]. В связи с этим, было высказано предположение, что описанные формы КПН участвуют в процессинге различных по своей функциональной роли пептидов: растворимая КПН принимает участие преимущественно в образовании секреторных пептидов, в то время как мембраносвязанная форма участвует процессинге пептидов, обладающих местным действием [40, 65].
Тканевая, региональная, клеточная и субклеточная локализация фермента была изучена с применением флюориметрических и радиометрических методов определения активности КПН. Наиболее высокая активность КПН обнаружена в хромаффинных гранулах надпочечников, аденогипофизе и островках Лангерганса поджелудочной железы [191, 194, 203, 206]. Более низкая - в задней доле гипофиза, стриатуме, гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [37, 149, 194]. Самая низкая активность КПН отмечена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, сердце, легких, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [149]. Установлено, что фермент локализован в хромаффинных гранулах надпочечников, нейронах мозга, содержащих вещество Р, энкефалины и другие нейропептиды, гормон-продуцирующих клетках гипофиза, a- и b- клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, продуцирующих ин?