Курсовая работа: Биотехнология глутамата натрия

рН среды 7,0-7,2

Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 24 ч. Эта стадия выращивания контролируется по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие показатели дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.

На второй стадии выращивания посевного материала (рис.6) готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор) объемом 2м3. Происходит накопление биомассы до 6-8 г АСВ на 1 л среды в аэробных условиях. Состав питательной среды такой же как и при выращивании в колбах Эрленмейера, но с добавление 0,1% стерильного синтетического пеногасителя. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.

Третья стадия (рис.6) культивирования посевного материала повторяет вторую стадию, но процесс уже осуществляется в инокуляторах объемом 5м3. Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится пострерилизованная питательная среда того же состава, что и использовалась на предыдущей стадии. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2. По завершении процесса ферментации в посевных аппаратах культура не должна содержать фагов, посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. Полученный посевной материал в количестве 5-6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы.

Посевные аппараты на второй и третьей стадии оснащены мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т.д. Количество посевного материала, передаваемое в инокуляты, может варьировать в широких пределах от 1 до 20% по объему. Коэффициент заполнения посевного аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов составляет 0,5-0,7. Перемешивание среды достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300об/мин.

Четвертая стадия (рис.6) процесса осуществляется в основных биореакторах (рис.7) объемом 50м3 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации (80-85 мг О2/(л*мин)). Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28-30С. Такие аппараты должны обеспечить нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асептических условиях; они снабжены необходимыми коммуникациями, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуцерами для подачи питательной среды и соответствующим оборудованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для поддержания рН среды на необходимом уровне, системами ввода стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при 0,1 МПа.

Стерильная питательная среда (рис.8) в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (28-30С), или около 80С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.

Для промышленных штаммов С. glutamicumпитательные среды на стадии биосинтеза содержат следующие компоненты (в %):

Меласса 20

Мочевина 2

Калия фосфат двухзамещенный 0,05

Сульфат магния 0,03

Вода остальное

рН 7,0-7,2

Дополнительно в питательную среду вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. Мочевину вводят дробно, по мере потребления, чтобы содержание мочевины в среде не превышало 0,8%.

Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего составляет 0,7. Процесс ферментации продолжается при повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-30С и контролируемом значении рН; периодически производится подача стерильного пеногасителя.

В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза глутаминовой кислоты – 0,8-1,0 г/л*ч. Питательная среда сильно истощается, возможно значительное изменение рН раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования глутамата.

Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 50 г/л глутаминовой кислоты, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50%.

Количество накапливаемого глутамата удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «подпитки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости глутамата до 60/л.

Рис. 7: Схема ферментатора со вспомогательными устройствами: 1 – корпус ферментатора, 2 – вал смесителя с турбинами, 3 – электродвигатель с коробкой передач, 4 – сальник вала смесителя, 5 – спираль теплообменника, 6 – перфорированный барботер, 7 – устройство для определения расходов воздуха, 8 – фильтр для стерилизации воздуха, 9 – воздушный клапан с регулировочным вентилем, 10 – уловитель, наполненный фенолом, 11 и 12 – резервуары для стерилизации пеногасителя и дополнительной подачи питательной среды во время ферментации, 13 – трубопровод для питательной среды, 14 – выводной вентиль, 15 – вентиль для отбора проб.

Рис. 8: Схема непрерывного приготовления питательной среды: 1 и 2 – резервуары для растворения исходных веществ, 3 – резервуар для смешивания растворов, 4 – насос для передачи среды, 5 – колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 – закрытый сосуд для стерилизации, 7 – охладитель, 8 – резервуар для спуска нагретой воды, 9 – ферментатор

Пятая стадия включает в себя предварительную обработку культуральной жидкости. Осуществляется в результате добавление к ней определенного количества негашеной извести с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.

Шестая стадия – отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением (рис.9). Осадок и отработанную биомассу – в отходы.

Рис. 9: Рамный фильтр-пресс: 1 – лобовина, 2 – рама, 3 – плита, 4 – брус, 5 – подвижная лобовина, 6 – гидравлическое устройство, 7 – прилив, 8 – кран.

Седьмая стадия – осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем.

Восьмая стадия заключается в концентрировании осветленного раствора глутаминовой кислоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания (рис.10) при температуре 40-60С, при этом из исходного раствора глутамата отгоняют от 50 до 80% воды.