Курсовая работа: Ферменты дереворазрушающих грибов
Мn-зависимая пероксидаза – гемсодержащий фермент (КФ 1.11.1.3), участвующий в деполяризации синтетического лигнина [16]. Она окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Проявляет активность в среде, содержащей Мn, имеет молекулярную массу 46 кДа [8]. Впервые выделена из культуральной жидкости гриба Ph . chrysosporium . Принцип функционирования фермента заключается в окисление Мn2+ до Мn3+ с использованием пероксида водорода в качестве окислителя. Активность фермента стимулируется простыми органическими кислотами, которые стабилизируют ион Мn3+ . В результате взаимодействия последнего с кислотами образуется хелат, обладающий окислительными свойствами [16]. Регенерация Мn осуществляется сопряженной реакцией разложения перекиси водорода. При отсутствии в среде Н2 02 Мn-зависимая пероксидаза способна продуцировать пероксид водорода. Мn-зависимая пероксидаза отмечена у таких грибов как Trametes versicolor, Phlebia radiate, Dischomitus squalens и др. [13].
П. Флавинсодержащие ферменты,осуществляющие, в основном двухэлектронное восстановление молекулы кислорода до перекиси водорода и одновременно двухэлектронное окисление ОН-группы, соответствующих субстратов, до карбонильных групп. Среди них – глюкозооксидазы, пиранозо-2-оксидазы, метанол-оксидазы, арилалкогольоксидазы [13].
Глюкозооксидаза – флавинсодержащая оксидаза с молекулярной массой 80 кДа, катализирующая окисление глюкозы, восстанавливая при этом кислород до перекиси водорода. Глюкозооксидаза выявлена у грибов Pa n us tigrinus, P. Chrysosporium [8].
Пираноза-2-оксидаза ароматических спиртов, катализирует окисление низших первичных и ароматических спиртов до соответствующих альдегидов и пероксида водорода [13].
Арилалкогольоксидаза(вератрил-алкоголь оксидаза), внеклеточная флавин-оксидаза с молекулярной массой 72,5-78 кДа, катализирует окисление ароматических спиртов до альдегидов, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Арилалкогольоксидаза отмечена у грибов, вызывающих белую гниль древесины: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor [13].
Метанолоксидаза(МеО), внеклеточный флавин-содержащий фермент с молекулярной массой 75 кДа, катализирует окисление метанола, выделяющийся при деградации лигнина в реакциях деметилирования фенолов, до формальдегида, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Выделена и охарактеризована у Phanerochaete chrysosporium , Trametes versicolor , Panus tigrinus [13].
III. Медьсодержащие ферменты. Разделяют на две группы.
III.1 Голубые оксидазы – лакказа и родственные или им неголубые оксидаза, осуществляющие четырехэлектронное восстановление кислорода до воды с параллельным одно- или двухэлектронным окислением преимущественно фенольным субстратом до соответсвующих феноксирадикалов или хинонов. [8]
Катехолоксидазаучаствует в гидроксилировании монофенолов до дифенолов и окислении дифенолов в ортохиноны. Она широко распространена среди микроорганизмов и имеет названия, соответствующие катализируемому субстрату: монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, фенолаза, крезолаза, тирозиназа и т. п. [13].
Лакказы (бензидол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) – голубая медьсодержащая оксидаза, которая катализирует четырехэлектронное окисление фенолов, ароматических аминов и фенилендиамина, используя кислород как акцептор электронов с восстановлением его до воды. Практически все исследованные лакказы – это мономеры, гликопротеины с углеводной частью от 1 до 15% массы фермента, которая состоит из остатков маннозы и N-ацетилглюкозамина [16]. Окисляют широкий круг субстратов преимущественно фенольной природы с образованием феноксильных радикалов, а также нефенольные соединения в присутствии специфических электронных переносчиков ABTS или HBT(1-гидроксибензотриазол) [16]. Лакказы древоразрушающих грибов имеют более низким Ph-оптимумом окисления фенольных субстратов, совпадающим с оптимум действия большинства грибных целлюлаз. Так, для лакказ Gaeumannomyces graminis var . tritici , древоразрушающего базидиомицета PM1, Coriolus histris он близок к 4,5Ph, для лакказ других трутовиков (C . zonatus , Tramenas sanguinea , Polyporus pinsitus ) составляет 4,9 Ph-5Ph [4].
III.2 Медьсодержащие ферменты, осуществляющие двухэлектронное восстановление кислорода до перекиси с одновременным двухэлектроным окислением подходящей спиртовой или альдегидной группы (глиоксальоксидаза, галактооксидаза) [8].
Наибольшей оксидазной активность обладают штамма Trametes hirsute D-5 и Gerrena unicolor М-2 [18].
Лигнин под действием бурых гнилей преимущественно гидроксилируется и деметилируется и в меньшей степени депомилиризуется. Окисление непосредственно идет до углекислоты с изъятием углерода в основном из боковых цепей и метоксильных групп [13].
Предположительно, лигнинразрущающие ферменты действуют на поверхности гиф, находящихся в контакте с клеточной стенкой. Вместе с тем, разложение наблюдается не только в местах контакта, но и по всей поверхности люмена, если там находятся всего одна-две гифы гриба, и даже в толще вторичной оболочки. Снижение выхода низкомолекулярных продуктов окисления лигнина (ароматических кислот и альдегидов) после обработки древесины лигнинразрушающими грибами объясняет их окислительным и конденсирующим действием. Однако разные грибы в разной степени окисляют и конденсируют остаточный лигнин [4].
Так было показано, что выявленная на поверхности мицелия внеклеточная лакказа штамма гриба Pleurotus ostreatus Dl могут участвовать в начальных этапах метаболизма полициклических ароматических углеводородов (в данной работе хризена). Тогда как гибридная Mn-пероксидаза окисляла образующиеся метаболиты (фталевая кислота) [12].
3. Целлюлитический комплекс дереворазрушающих грибов
Целлюлоза очень ценный материал из которого можно получать множество продуктов, например этанол. Она является наиболее простым компонентом лигноцеллюлозного материала и самым распространенным природным полимером. Его длинные цепи состоят из остатков D-глюкозы соединенных β-1,4 связями. Целлюлоза отличается по строению от крахмала. В целлюлозе полимерные цепи упакованы так, что образуют кристаллоподобную структуру, непроницаемую для воды. Поэтому она не растворяется в воде и устойчива к гидролизу [1].
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы, самого распространенного биополимера на Земле, занимают центральное место в круговороте органического углерода [2]. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы возбудители мягкой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет, В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубокой деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы [19]. Целлюлазы этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [14], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности. Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности [6]. В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы [4]. Обнаружение ферментов с такой (тополитическая активность) активностью открыло новые возможности их применения. Например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т, д. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую активность [20].
Разрушение материала клеточных стенок под действием ферментов грибов наблюдается по появлению зон растворения вокруг гиф. Зона растворения постепенно увеличивается и гифа проникает сквозь внутренний слой клеточной стенки [4].
Всего выделяют 3 основных типа целлюлаз, которые катализируют различные типы реакции:
а) Эндоцеллюлаза разрывает внутренние связи, для того чтобы нарушить кристаллическую структуру целлюлозы. В результате образуются отдельные полисахаридные цепи целлюлозы.
б) Экзоцеллюлаза отщепляет от концов 2 или 4 остатка, в результате образуются тетрасахара или дисахариды, состоящие из целлобиозы. Выделяют два основных типа экзоцеллюлаз (или целлобиозодегидрогеназ). Первый тип отщепляет от редуцирующего конца. Второй тип от нередуцирующего конца целлюлозы.
в) Целлобиоза или бета-глюкозидаза гидролизуют продукты экзоцеллюлаз до моносахаров.
Оксидативные целлюлазы деполимеризуют целлюлозу радикальными реакциями. В случаи акцептора может выступать целлобиоза [21].
Целлюлитический комплекс грибов включает две большие группы:
1. Гидролазы, осуществляющие расщепление структурных полисахаридов клеточной стенки древесины, в том числе большая группа гликозилгидролаз, эндо- и экзополигалактуроназа и целый ряд других гликаназ и глюкозидаз, отщепляющих боковые остатки в основной цепи гемицеллюлаз и пектиназ. В это группу также включают некоторые эстеразы, помогающие гликозилгидролазам в расщеплении основных цепей структурных полисахаридов клеточной стенки (пектин-метилэстераза, ферулоилэстераза, ацетилксиланэстераза). Под гликозилгидролазой понимают ряд ферментов, такие как эндо- и экзоцеллюлаза, гемицеллюлаза, эндо- и экзоксиланазы, эндо- и экзоманназы, β-глюконаза.
2. Оксидоредуктазы, действующие на углеводные компоненты древесины. К ним относят глюкозооксидаза, галактозооксидаза, целлобиозодегидрогеназа [8].
Эндоглюканаза гидролизует β-1,4 связи между соседними остатками глюкозы в плотно упакованных областях целлюлозы, образуя разрывы в середине цепи.
Экзоглюканаза расщепляет разорванные целлюлозные цепи с нередуцирующих концов с образованием глюкозы, целлобиозы или целлотриозы.