Курсовая работа: Фосфолипазы, их классификация и свойства
В настоящее время описано десять типов секреторной ФЛА2 (IВ, IIА, IIC, IID, IIE,IIF,III,V, X,XII) которые различаются первичной структурой и расположением дисульфидных мостиков. Все типы секреторных фосфолипаз представляют собой глобулярные белки, богатые цистеином (5-8 дисульфидных мостиков), что обеспечивает стабильность фермента, в том числе устойчивость к протеолизу и денатурации. Фермент не проявляет избирательности в отношении жирнокислотного состава фосфолипидов, но предпочтительно гидролизует отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидную кислоту и фосфатидилглицерол).
Долгое время была известна только одна ФЛА2, которая в изобилии присутствует в панкреатической жидкости (тип IB). В 1989 г. была открыта и клонирована фосфолипаза типа IIA, которая хранится в секреторных гранулах тромбоцитов и концентрация которой значительно увеличивается в местах воспаления, таких как синовиальная жидкость при ревматоидном артрите. Эти белки имеют большое сходство с белками яда змей. Среди белков ядов пчёл и ящериц были обнаружены другие фосфолипазы, которые отнесены к типу III. У млекопитающих белок, соответствующий этому типу, был обнаружен только в 2000 г.. Новый период в исследованиях секреторных фосфолипаз начался в 1994 г., когда были открыты белки типа IIC и V. Это открытие привело к пересмотру роли этого семейства белков в регуляции функций клеток и интенсивному поиску новых аналогичных белков. Были открыты белки типа X, IID, IIE и IIF, XII.
Все эти белки (кроме белка типа III) имеют молекулярную массу 14-17 кДа, содержат гистидин в каталитическом центре и проявляют фосфолипазную ктивность в присутствии миллимолярных концентраций кальция. Они имеют высококонсервативные аминокислотные последовательности в каталитическом участке (DXCCXXHD) и участке кальцийсвязывающей петли (XCGXGG), а также 6-8 консервативных сульфидных мостиков. В активном центре находится также аспартат, который совместно с кальцийсвязывающей петлей выполняет роль кармана для иона Ca2+.
Ферменты этого семейства не проявляют специфичности ни по отношению к группе, связанной с остатком фосфатидной кислоты, ни по отношению к ацильной группе в положении sn-2. Наличие в фосфолипидах окисленных форм жирных кислот увеличивает активность секреторных фосфолипаз, что предполагает их участие в регуляции вязкости мембран при окислительном стрессе. Из данных рентгеноструктурного анализа первых двух групп белков следует существование гидрофобного канала, в который входит молекула фосфолипида после межфазного связывания белка на фосфолипидной поверхности.
Секреторная ФЛА2 конститутивно содержится в различных клетках, участвующих в развитии иммунных и воспалительных ответов: макрофагах, тучных клетках, фибробластах и тканях таких органов, как печень, селезенка, тимус, костный мозг, кишечник. Активность фермента на уровне клеток регулируется за счет его индукции различными воспалительными стимулами (интерлейкин-1 и интерлейкин-6, фактор некроза опухоли,липополисахарид, интерферон-g, форболовые эфиры, фактор роста нервов). В соответствии с индукцией разнообразными стимуляторами промотер гена IIA содержит нуклеотидные последовательности TATA и CAAT, а также последовательности связывания таких факторов транскрипции, как AP-1, C/EBP, CREB, NF-kB, STAT, PPA Rg. В некоторых клетках экспрессия ФЛА2 зависит от предварительной активации цитозольной фосфолипазы PLА2a, при этом предполагается вовлечение в процесс регуляции фосфолипазы IIA продуктов 12/15- липоксигеназного пути. Глюкокортикоиды (стероидные противовоспалительные препараты) являются супрессорами экспрессии фосфолипазы IIA.
Изменение экспрессии фосфолипазы IIA во многих случаях связано с модуляцией простагландиновой ветви каскада арахидоновой кислоты. Так, при стимуляции интерлейкином-1 и фактором некроза опухоли активировался как синтез и секреция фосфолипазы, так и синтез простагландина Е2 и простациклина в мезангиальных или эндотелиальных клетках, соответственно. При добавлении к клеткам антител к фосфолипазе синтез простациклина частично подавлялся. Из результатов, полученных в последние годы, следует, что секреторные фосфолипазы (IIA и схожие с ней V, X) участвуют в процессах как быстрой, так и замедленной продукции арахидоновой кислоты и простаноидов.
Следует отметить, что добавление секреторных фосфолипаз во внеклеточную среду приводит к активному высвобождению арахидоновой кислоты и синтезу простаноидов активированными клетками, но практически не влияет на гидролиз фосфолипидов мембран покоящихся клеток.
Помимо роли фермента, ответственного за наличие арахидоновой кислоты, секреторные фосфолипазы могут выступать в роли физиологически активных веществ. Так, в тучных клетках специфические ингибиторы секреторных фосфолипаз уменьшали стимулированную фактором роста нервов экспрессию циклооксигеназы-2. При этом каталитически неактивные мутанты белка фосфолипазы также были способны вызывать экспрессию циклооксигеназы-2, т.е. этот эффект не зависит от ферментативных свойств фосфолипазы. Механизм этого процесса не ясен. Возможно, вовлекаются функции секреторной ФЛА2 как лиганда специфических рецепторов.
Действительно, в 1995 г. было показано, что существуют специфические белки, которые связываются с фосфолипазой типа IB (константа диссоциации образовавшегося комплекса 1 нмоль/л) и проявляют различные биологические эффекты. За последующие 10 лет обнаружено ещё много белков, растворимых и мембраносвязанных, которые способны связывать секреторную фосфолипазу. Однако свойства «классического» рецептора, который при связывании лиганда активирует систему внутриклеточной передачи сигнала, проявляет только один из этих белков. Это белок M-типа, или sPLA2R. Ген данного белка локализован во второй хромосоме; белковая последовательность имеет 75 % гомологии среди ряда видов млекопитающих; ген имеет 1 копию и ничем не похож на другие гены. Белок имеет молекулярную массу 180-200 кДа, значительная его часть расположена во внеклеточной области, в цитозоле находится последовательность из 40 аминокислотных остатков. Белок без этого цитозольного участка встречается в растворимой форме и показана его роль как ингибитора эффектов секреторных фосфолипаз. У человека белок экспрессирован в поджелудочной железе, лёгких и почках. Показана важная роль активации этого рецептора в развитии эндотоксического шока.
На рисунке представлена схема участия рецептора секреторной фосфолипазы в реализации биологической роли фермента на уровне клеток.
На схеме показано, как активные формы фосфолипазы sPLA2-IB или sPLA2–X проявляют свою ферментативную активность, что приводит к появлению липидных медиаторов, а также являются высокоаффинными лигандами для рецептора, локализованного в плазматической мембране. Взаимодействие фосфолипазы с рецептором мембраны приводит к индукции митогенактивированных протеинкиназ (MAPK) и соответствующего пути внутриклеточного проведения сигнала, что стимулирует различные ответы клеток: пролиферацию и миграцию клеток, синтез ими физиологически активных веществ. При потере контакта с мембраной рецептор сохраняет возможность связывать фосфолипазу, что позволяет регулировать активность последней как фермента и как лиганда.
Таким образом, секреторные фосфолипазы играют существенную роль в развитии и распространении воспалительных процессов в организме. Экспрессия секреторных фосфолипаз значительно увеличивается при разнообразных воспалительных заболеваниях. По этой причине разрабатывают селективные ингибиторы ферментативной активности белков этого семейства как потенциально новый класс противовоспалительных веществ. Для поиска ингибиторов секреторных фосфолипаз перспективно применение методов компьютерного моделирования, так как эти низкомолекулярные белки (их молекулярная масса около 14 кДа) получены в кристаллическом состоянии, известны их трёхмерные структуры. Есть основания полагать, что в ближайшие 5-10 лет на основании результатов этих исследований будут созданы новые терапевтические технологии и новые лекарственные средства.
2.2.3 Кальцийнезависимая ФЛА2
Классическая кальцийнезависимая ФЛА2 (iPLA2-VIA) существует в олигомерной форме и имеет несколько сплайс-вариантов, из которых, по крайней мере, два (VIA-1 и VIA-2) обладают ферментативной активностью. Белок iPLA2-VIA-1 имеет молекулярную массу 85 кДа; содержит 8 анкириновых повторов в области N-конца, каталитический домен с характерной аминокислотной последовательностью GXSXG, где S – серин-465 действует как центр катализа. Имеется также ATP-связывающая последовательность GXGXXG. Около С-конца (в области аминокислотных остатков 694-705) существует связывающая область для калмодулина. Образование комплекса белка iPLA2-VIA с активированным калмодулином (т. е. в присутствии ионов Ca2+) приводит к инактивации данной фосфолипазы. Хотя обе сплайс-формы VIA-1 и VIA-2 имеют ATP- связывающие последовательности, показано, что только белкок iPLA2-VIA-2, но не iPLA2-VIA-1, активируется в несколько раз в присутствии ATP.
Анкириновые повторы встречаются у нескольких сотен белков, таких как факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла. Считается, что данный мотив участвует в белок- белковых взаимодействиях. Предполагают, что в клетках белок iPLA2-VIA присутствует в виде тетрамера и, возможно, анкириновые мотивы участвуют в олигомеризации белка. Фосфолипаза iPLA2-VIA не специфична к природе жирных кислот в положении sn-2 и заместителю в положении sn-3 фосфолипида; полностью активна в отсутствие кальция и осуществляет межфазный катализ. Фермент также проявляет лизофосфолипазную активность по положению sn-1, трансацилазную активность и активность, характерную для белка PAF-AH.
Белок iPLA2-VIB содержит липазный мотив GVSTG, где серин-483 находится в каталитическом центре; ATP-связывающий мотив; мотив сигнала локализации в пероксисомах на С- конце молекулы. С-концы молекул, включая ATP-связывающий повтор и каталитический участок, белков iPLA2-VIB и iPLA2-VIA сходны. Отличия наблюдаются в N-конце белка, где у белка iPLA2- VIB нет анкириновых мотивов, много сериновых и треониновых остатков, часть которых может фосфорилироваться протеинкиназами А и С. Также имеются пять участков Ser-Pro, которые являются мишенями для пролиновых киназ. Одна из этих последовательностей (PTSP, остатки 269-272) является сайтом фосфорилирования митогенактивированными протеинкиназами. От ионов кальция активность данной изоформы не зависит. Наличие различных участков фосфорилирования у белков группы iPLA2-VI указывает, что роль белков iPLA2-VIA и iPLA2-VIB в клетках может отличаться. Обе кальцийнезависимые фосфолипазы (iPLA2-VIA и iPLA2-VIB) являются мембраносвязанными белками.
2.3 Субстратная специфичность
Катализ код действием ФЛА2 характеризуется поверхностной, позиционной и стерической специфичностью фермента. Фосфолипаза катализирует реакцию на поверхности раздела липид/вода. С одной стороны, для большинства липолитичсскнх ферментов, включая и ФЛА2, активность фермента оказывается значительно выше при существовании субстратов в форме агрегатов (мицелл, смешанных мицелл, монослоев и бислоев), чем при действии на водорастворимые субстраты в мономолекулярной форме.
С другой стороны - ФЛА2 не действует на липидные молекулы в составе плотно упакованных и, следовательно, труднодоступных липидных агрегатов. Для создания поверхности раздела фаз в этих случаях обычно используют детергенты (тритон х-100, дезоксихолат натрия). Доказано, что для оптимального проявления поверхностной специфичности фермента необходимо наличие агрегированных субстратов с определенной длиной ацильной цепи.
С обнаружением стерической и позиционной специфичности ФЛА2, были сформулированы довольно строгие минимальные требования фермента к субстрату: в положении sn-2 глицеринового остатка липид должен содержать сложноэфирную группу, а в положении sn-з - фосфатную. Позднее было показано, что ?